磁性靶向胎盘间充质干细胞（PL-MSCs）通过氧化应激与炎症抑制改善顺铂诱导急性肾损伤（AKI）的治疗效果

　　本研究创新性地利用聚多巴胺包被的四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4@PDA NPs）标记胎盘间充质干细胞（PL-MSCs），结合外部磁场引导，显著提升干细胞在顺铂（Cis）诱导急性肾损伤（AKI）小鼠模型中的靶向归巢能力和治疗效果。结果表明，磁性靶向技术通过抑制氧化应激（ROS、MDA、8-OHdG）和炎症反应（TNF-α、IL-1β等），减少细胞凋亡（TUNEL），促进增殖（Ki67），从而有效改善肾功能（BUN、Cr）和组织修复。

　　

Abstract

Background

急性肾损伤（AKI）以肾功能突然丧失为特征，目前缺乏有效治疗方法。胎盘来源的间充质干细胞（PL-MSCs）在再生医学中展现出潜力，尤其在AKI治疗方面。然而，如何优化PL-MSCs的治疗效果仍是关键挑战。磁性靶向技术是一种潜在的优化策略。通过使用氧化铁标记的MSCs并结合外部磁场，可提高细胞的归巢能力，从而增强体内细胞治疗效果。

Methods

本研究用聚多巴胺包被的四氧化三铁纳米颗粒（Fe₃O₄@PDA NPs）对PL-MSCs进行24小时标记，并检测细胞效率与存活率。将条件性永生化的小鼠肾小管内皮细胞（mRTECs）与顺铂（Cis）共孵育后，再与非标记或NP标记的MSCs共培养，评估NP标记MSCs对mRTEC的保护作用。在体内实验中，对顺铂诱导的AKI小鼠注射非标记或NP标记的MSCs，并施加或不施加外部磁场，收集血液和组织样本以评估肾功能和组织损伤。

Results

研究证实MSCs或MSC-NP能显著改善顺铂诱导的mRTEC损伤。此外，在外部磁场作用下的NP标记MSCs（磁性靶向MSCs）提高了其在AKI小鼠肾组织中的归巢能力，与单独使用MSC或NP标记MSC治疗相比，肾功能得到进一步改善。磁性靶向MSCs通过抑制氧化应激和炎症、减少细胞凋亡并促进细胞增殖来减轻肾损伤。

Conclusion

磁性靶向技术可增强PL-MSCs对顺铂诱导的小鼠AKI的治疗效果，表明磁性靶向MSCs有望成为治疗顺铂诱导AKI的潜在策略。

Introduction

顺铂（Cis）是一种广泛用于治疗多种实体瘤的化疗药物，但其临床应用常因多器官严重不良反应而受限。约三分之一接受顺铂治疗的患者可能出现肾毒性，包括急性肾损伤（AKI）。顺铂可诱导肾小管上皮细胞发生凋亡、炎症反应和纤维化。尽管现有治疗手段如液体管理和持续血液净化疗法可供选择，但目前尚无特异性药物治疗顺铂诱导的AKI。

间充质干细胞（MSCs）作为组织工程和再生医学中的重要细胞来源，存在于人体骨髓、皮肤、脐带组织和脂肪组织中。越来越多的实验证据表明，MSCs可用于改善顺铂诱导的肾损伤，保护肾小管结构和功能。然而，从骨髓等组织中分离MSCs的过程具有侵入性，且常需多次采样才能获得足够数量。胎盘来源MSCs（PL-MSCs）因其在分娩后易于获取、细胞产量高、增殖能力强、免疫原性低等优点，成为再生细胞治疗的有力工具。PL-MSCs比成体骨髓MSCs具有更强的扩增潜力和免疫调节能力。临床前研究表明，PL-MSCs可分泌免疫调节和血管生成细胞因子，有助于组织愈合和重塑。目前，PL-MSCs已在多种疾病动物模型中得到研究，包括多发性硬化、勃起功能障碍、冠状病毒病、慢性肺损伤和肾脏疾病。因此，PL-MSCs可能成为AKI细胞治疗的重要来源。

MSCs的治疗效果很大程度上取决于成功到达靶点部位的细胞数量。静脉输注后，仅少部分细胞能够到达目标组织，表明MSCs的归巢效率较低。因此，寻找有效的细胞递送方法以增强细胞向靶点归巢至关重要。

纳米技术的发展为解决这一公共卫生问题提供了新方法。磁性靶向递送作为一种新兴递送技术，主要包括磁性颗粒、载荷和载体三部分，近年来日益受到关注。在该系统中，载体可响应特定磁场并被引导至靶点，从而增加靶点处药物或细胞的浓度，同时减少毒性和脱靶副作用。目前最广泛使用的磁性载体是四氧化三铁纳米颗粒（Fe₃O₄ NPs），其具有磁性、低毒性和高生物相容性。Fe₃O₄ NPs在癌症治疗中已被广泛应用，无论是作为抗癌药物的磁性靶向递送载体，还是作为热疗剂以增强化疗药物疗效。聚多巴胺包被的Fe₃O₄ NPs（Fe₃O₄@PDA NPs）表现出增强的超顺磁性、更好的生物相容性和更低的毒性，因此更适用于临床治疗。用Fe₃O₄@PDA NPs标记特定细胞可增加细胞从血液向肾脏靶点的迁移和分布。研究表明，磁性靶向引导的MSCs可用于修复其他损伤，如软骨损伤、脊髓损伤和心肌梗死。此外，有研究显示磁性靶向PL-MSCs可最大化其对胶质瘤的治疗效果。

本研究旨在评估一种非侵入性方法，即通过标记Fe₃O₄@PDA NPs刺激细胞到达损伤部位，从而促进MSCs在AKI小鼠损伤部位的招募，以增强PL-MSCs的再生能力。同时，我们评估了Fe₃O₄@PDA标记MSCs对小鼠AKI模型的治疗效果。

Materials and Methods

Cell Culture

人PL-MSCs的培养方法如前所述。所有操作均经吉林大学中日联谊医院研究伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》。PL-MSCs培养于含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基中。条件性永生化的小鼠肾小管内皮细胞（mRTECs）购自上海细胞生物学研究所，培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基中。所有细胞均置于37°C、5% CO₂的培养箱中培养。

The Preparation of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) with Fe₃O₄ Coated with Polydopamine Nanoparticles

Fe₃O₄@PDA NPs的合成与表征如前所述。将PL-MSCs培养于六孔板中，细胞汇合后更换培养基，并分别加入25–200 μg/mL的Fe₃O₄@PDA NPs，孵育24小时。用PBS冲洗去除多余NPs。

Detection of Intracellular Iron via Prussian Blue Staining

PL-MSCs培养至80%汇合时，加入不同浓度NPs孵育24小时。标记后的MSCs用4%多聚甲醛固定30分钟，按试剂盒说明进行普鲁士蓝染色，显微镜下观察。

Measurement of MSC Cytotoxicity and Proliferation After Labeling with Fe₃O₄ Coated with Polydopamine Nanoparticles

PL-MSCs分别与25–200 μg/mL的Fe₃O₄@PDA NPs共孵育24小时，采用CCK8检测细胞活性。另有一部分细胞标记后继续培养7天，再用CCK8法评估细胞增殖。选择细胞毒性最低的NP浓度进行后续实验。

Detection of Intracellular Iron Using Transmission Electron Microscopy

标记后的PL-MSCs用2.5%戊二醛固定过夜，PBS清洗后用1%锇酸后固定2小时，乙醇梯度脱水后采用透射电镜（TEM）观察。

Identification of Stem Cell Characteristics in Nanoparticle-Labeled MSCs

PL-MSCs用Fe₃O₄@PDA NPs标记24小时后，与抗体CD73、CD45、CD34、CD19、CD11b、CD90、HLA-DR、CD105共同孵育，流式细胞术分析表型。同时，通过成脂和成骨诱导培养基分别培养21天和28天，油红O和阿利新红染色评估多向分化潜能。

Indirect Co-Cultures of Cis-Stimulated Mice Renal Tubular Endothelial Cells and Nanoparticle-Labeled or Unlabeled MSCs

mRTECs用2.5 μg/mL顺铂处理6小时，之后更换正常培养基。另外两组在顺铂处理后分别与非标记或NP标记的MSCs在Transwell中共培养24小时。MSCs接种于上室，mRTECs接种于下室。

Detection of Apoptosis and Reactive Oxygen Species Levels via Flow Cytometric

共培养后收集mRTECs，用Annexin V/PI染色检测凋亡，ROS检测试剂盒检测活性氧水平，流式细胞术分析。

Cytoprotection Assay

mRTECs接种于24孔板，顺铂处理6小时后与MSCs或MSC-NP共培养24小时，CCK8法评估细胞生长抑制。

Measurement of Lactate Dehydrogenase, l-Glutathione, and Malonaldehyde Levels

收集细胞上清和细胞沉淀，BCA法测蛋白浓度，ELISA试剂盒检测LDH、GSH和MDA水平。

Animal Studies Using Mouse Model

6–8周龄C57BL/6雄性小鼠单次腹腔注射顺铂（18 mg/kg）诱导AKI。24小时后随机分为四组，分别尾静脉注射：PBS、MSC、MSC-NP、磁性靶向MSC（MSC-NP-MAG），并在肾区下方放置磁铁（1.2 T）20分钟。第7天处死小鼠，收集血液、尿液和肾脏样本。为追踪MSCs归巢，部分小鼠注射Cy5.5标记的MSCs，24小时后取肾进行小动物成像。

Biochemical Analysis

采用试剂盒检测血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平。

Measurement of Serum Cytokine Levels

Luminex多重检测法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IFN-γ等炎症因子水平。

Histology

肾组织切片进行HE和PAS染色，显微镜下观察并盲法评估。

Immunohistochemistry

肾组织切片脱蜡、水化、抗原修复后，与一抗8-OHdG、CD3、CD11b、CD68、Ki67、KIM-1、TIMP-1等孵育，DAB显色。细胞水平8-OHdG检测方法类似。

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP-Biotin Nick-End Labeling Staining

采用TUNEL检测试剂盒评估肾组织细胞凋亡，阳性细胞计数进行组间比较。

Statistical Analysis

数据以均值±标准差表示，SPSS软件进行统计分析。正态性和方差齐性检验后，t检验用于两组比较，多组比较采用单因素ANOVA及Bonferroni检验。P<0.05认为有统计学意义。

Results and Discussion

Fe₃O₄@PDA NPs的形态和大小与既往研究一致。普鲁士蓝染色显示，未标记MSCs无蓝色颗粒，而NP标记组（50 μg/mL和100 μg/mL）几乎全部细胞呈阳性，且50 μg/mL组染色强于更高浓度组。透射电镜显示NPs位于胞质内内体样结构中。

CCK8分析显示，NP浓度低于100 μg/mL时，MSC-NP与未标记PL-MSCs的活性无显著差异；浓度≥150 μg/mL时则出现细胞毒性。细胞增殖实验表明，25和50 μg/mL NP浓度对MSCs增殖无显著影响。因此后续实验选用50 μg/mL NP浓度。

流式细胞术和分化实验表明，NP标记并未改变MSCs的表面标志物表达和多向分化能力，说明NPs对PL-MSCs无毒性且不影响其干细胞特性。

在体外共培养实验中，与顺铂组相比，MSCs或MSC-NP共培养的mRTECs存活率显著提高（约2.3倍），LDH释放显著减少，细胞凋亡率显著降低。两组之间无显著差异，表明MSCs可能通过旁分泌机制发挥保护作用。

氧化应激指标显示，顺铂组GSH水平下降、MDA水平上升，而MSC和MSC-NP组可逆转这一趋势；ROS水平在顺铂组显著升高，MSC或MSC-NP处理后显著降低；8-OHdG表达在顺铂组升高，治疗组下降。进一步证实氧化应激参与顺铂肾毒性，且MSC-NP具有抗氧化潜力。

在动物实验中，与正常组相比，PBS组小鼠存活率下降（53%），而各MSC治疗组存活率均改善，磁性靶向组存活率最高（94%）。肾重测量显示，磁性靶向组对顺铂所致肾重减轻的防止效果最佳。血清生化指标显示，AKI小鼠BUN和Cr水平显著升高，各MSC治疗组均能降低这两项指标，磁性靶向组效果最显著。肾组织GSH和MDA水平变化进一步支持磁性靶向MSCs具有更强抗氧化能力。

小动物活体成像显示，磁性靶向组小鼠肾脏中Cy5.5标记MSCs的聚集量显著高于其他组，说明外部磁场有效促进了MSCs向肾组织的归巢。

组织学分析（HE和PAS染色）表明，顺铂组肾组织出现明显损伤如上皮细胞脱落、管型形成等，MSC和MSC-NP组损伤减轻，磁性靶向组肾组织形态接近正常。免疫组化显示损伤标志物KIM-1和TIMP-1在顺铂组表达上调，MSC和MSC-NP组部分减少，磁性靶向组几乎完全消除。8-OHdG在肾组织中的表达变化与体外结果一致。

炎症细胞浸润分析显示，顺铂组CD68+巨噬细胞、CD3+ T细胞和CD11b+ NK细胞数量增加，MSC和MSC-NP组上述细胞数量减少，磁性靶向组抑制效果最强。血清细胞因子检测表明，磁性靶向组IL-1β、IL-2、IL-5、IL-12、IFN-γ、TNF-α等炎症因子水平均低于其他治疗组，说明其抗炎效果更佳。

增殖与凋亡分析显示，顺铂组Ki67+细胞减少、TUNEL+细胞增加，MSC治疗组可逆转这一趋势，且磁性靶向组效果最为显著，表明其更能促进细胞增殖、抑制凋亡。

综上所述，磁性靶向MSCs通过提高损伤局部MSCs数量、增强旁分泌效应、释放更多具有免疫调节和抗炎作用的可溶性因子，从而在修复顺铂诱导的AKI方面表现出优于单纯MSCs或MSC-NP的治疗效果。

Conclusions

本研究成功利用外部磁场实现标记MSCs在AKI小鼠肾中的靶向递送。磁性NP标记结合外部磁场治疗可增加PL-MSCs在损伤部位的聚集，增强其旁分泌作用，释放更多具有免疫调节和抗炎作用的因子，从而改善恢复效果。磁性靶向是一种有前景的技术手段，可通过增强PL-MSCs在损伤部位的聚集能力来改善顺铂诱导的肾毒性。

Disclosure

王克和赵晔为共同第一作者。无利益冲突声明。

Data Sharing Statement

本研究所有数据均包含在本文中。