ManNAc通过GNE介导的代谢通道将UDP-GlcNAc导向N-糖基化修饰以降低Man5糖型丰度的机制研究

　　本研究发现ManNAc（N-乙酰-D-甘露糖胺）通过调控代谢流重塑单克隆抗体（mAb）糖基化谱：其经胞内摄取后转化为CMP-Neu5Ac（胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸），反馈抑制GNE（UDP-GlcNAc 2-表位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶）活性，从而将UDP-GlcNAc（尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺）从唾液酸合成通路转向N-糖基化过程，显著降低高甘露糖（Man5）糖型水平，为抗体糖型精准调控提供新策略。

　　

摘要

N-糖基化作为单克隆抗体（mAb）的关键质量属性，通过高甘露糖（Man5）糖型的调控在药代动力学和药效学中发挥核心作用。前期研究发现补充N-乙酰-D-甘露糖胺（ManNAc）可在不影响抗体产量或其他关键质量属性的前提下有效降低Man5水平，但其机制尚未明确。本研究通过多参数分析系统探讨了ManNAc的调控机制。细胞摄取研究显示，ManNAc处理后需3天潜伏期才开始降低Man5；转录组分析表明Man5相关酶（Mgat1、Mgat2、Man2a1、SLC35A3）的表达无显著变化，而代谢组学检测发现细胞内ManNAc、UDP-GlcNAc和CMP-Neu5Ac水平显著升高。机制研究揭示两个关键发现：（1）中国仓鼠卵巢（CHO）细胞内源性N-乙酰-D-葡糖胺-2-表位酶（AGE）表达极低；（2）CMP-Neu5Ac在体外强烈抑制GNE活性，尽管ManNAc对GNE无转录调控作用。研究者提出代谢流重定向模型：ManNAc衍生的CMP-Neu5Ac积累抑制GNE活性，从而将UDP-GlcNAc从唾液酸生物合成途径分流至N-糖基化通路，最终降低Man5水平。该工作不仅将UDP-GlcNAc底物限制确定为抗体糖基化的关键制约因素，还建立了外源单糖补充作为Man5优化的新型代谢工程策略。

1. 引言

N-连接糖基化是调控单克隆抗体（mAb）结构稳定性和效应功能的关键翻译后修饰，是生物治疗开发中的重要质量属性。Fc区CH₂结构域中保守的Asn297糖基化位点是Fcγ受体相互作用的关键介质，糖型异质性直接影响药代动力学和药效学特性。高甘露糖结构（尤其是Man5）具有双重功能后果：一方面通过增强FcγRIIIa结合亲和力提高抗体依赖性细胞毒性，另一方面通过甘露糖受体（MR）介导的内吞作用加速血清清除。这种双重性使Man5降低成为生物工艺开发的重要优化目标。

Man5生物合成途径起始于内质网介导的Glc₃Man₉GlcNAc₂前体合成，经糖苷酶修剪生成Man5中间体。随后顺式高尔基体中的N-乙酰葡糖胺转移酶I（Mgat1）催化β1-2 GlcNAc添加，形成复杂糖型。该关键反应协调包括Mgat2、Man2a1和其他糖基转移酶的酶促级联反应，生成成熟糖型。该途径受三个相互依赖因素的严格调控：（1）酶表达水平；（2）核苷酸糖底物可用性；（3）亚细胞运输动力学。

前期工作首次发现ManNAc可作为有效的Man5调节剂，通过早期补充（第4天前添加20-40 mM）实现>50%的降低，且不影响细胞活力或产品滴度。虽然该工艺优化证明了技术可行性，但基本机制问题仍然存在：是什么控制着关键的早期补充窗口？ManNAc通过哪个分子轴（酶调控还是底物通量）发挥作用？对Man5降低和G0F糖型升高同时发生的初步观察表明可能加速了Man5向G0F的转化，提示可能涉及Mgat1/Mgat2/Man2a1的转录调控或UDP-GlcNAc底物可用性的增强。

UDP-GlcNAc作为己糖胺通路的核心代谢物，分化为两个代谢命运：（1）直接用于聚糖链延伸；（2）通过GNE/MNK酶复合物转化为唾液酸前体。双功能GNE酶通过其表位酶结构域催化UDP-GlcNAc→ManNAc转化，而MNK结构域磷酸化ManNAc启动唾液酸生物合成。值得注意的是，终末唾液酸代谢物CMP-Neu5Ac通过寡聚化依赖机制对GNE产生反馈抑制。虽然ManNAc补充已通过唾液酸前体补充在GNE肌病治疗中进行临床探索，但其在生物工艺背景下通过调节唾液酸通路重新连接UDP-GlcNAc流量的潜在作用尚未被探索。

本研究解决了三个关键知识缺口：（1）外源ManNAc的代谢命运，即CHO细胞能否通过AGE介导的异构化将ManNAc转化为UDP-GlcNAc；（2）时间调控，即Man5降低前3天潜伏期背后的分子事件；（3）机制轴，即ManNAc主要影响酶表达还是底物可用性。通过整合转录组-代谢组分析，我们证明ManNAc给药通过唾液酸生物合成诱导CMP-Neu5Ac积累，随后通过已建立的反馈机制抑制GNE活性。这种代谢重编程将UDP-GlcNAc流量从唾液酸生产重新导向Mgat1介导的聚糖加工，从而解决Man5积累的底物限制问题。

2. 结果

2.1. CHO细胞从培养上清液中摄取ManNAc

为阐明ManNAc降低Man5的机制，需确定添加到培养基中的ManNAc是否被细胞摄取并参与分泌抗体的细胞内翻译后修饰。在补料分批培养中第0天添加20 mM ManNAc，结果显示培养基中实际ManNAc浓度相较于理论计算值逐渐降低，表明细胞部分摄取了ManNAc。使用30 mM ManNAc的重复实验观察到相似趋势。空白生产培养基中添加ManNAc的对照实验证实ManNAc在整个孵育期间保持稳定无降解，强化了其在 proposed 机制中的关键作用。

2.2. ManNAc补充持续时间对CHO培养物中Man5水平的影响

为确认ManNAc对Man5水平影响的持续时间，建立了四组不同ManNAc孵育条件的摇瓶补料分批培养：对照组（全程无ManNAc）、30 mM ManNAc组（第0天添加）、30-0 mM组（第0天添加，第7天离心完全更换上清液去除ManNAc）、0-30 mM组（第0天无添加，第7天更换上清液引入ManNAc）。数据显示各组间细胞生长、葡萄糖消耗、乳酸生产和抗体滴度相似。ManNAc补充组显示渗透压持续升高（比对照组高约30 mOsm/kg）和后期活力维持改善。

对照组中第10-14天表达的mAb的Man5水平显著高于第7-10天或0-7天，表明后期培养阶段Man5糖型成熟度较低。第7天通过离心更换上清液后，第7天后引入ManNAc的0-30 mM组在第7-10天将mAb Man5水平从5.8%±0.2%降低至4.1%±0.7%，表明ManNAc在3天内被摄取并发挥作用。该组在第10-14天Man5水平从13.1%显著下降至6.2%，突显了早期补充的关键作用。尽管第7天后去除ManNAc，30-0 mM组在第7-10天显示出与30 mM ManNAc组相当的Man5水平，表明第7天前细胞内积累的ManNAc继续减少Man5。

这些数据共同证明ManNAc被CHO细胞吸收并以缓慢速率在细胞内代谢。因此，建议在细胞平台期前进行早期补充以实现最佳Man5降低效果。

2.3. ManNAc参与细胞代谢和N-糖基化PTM期间的UDP-GlcNAc积累

蛋白质糖基化受底物、酶和转运蛋白的影响。在ManNAc补充组中，Man5水平显著降低，而G0F在未补充对照组中增加。这表明细胞内ManNAc可能通过改变底物浓度或酶活性减少从Man5到G0F的酶促过程。

为研究ManNAc是否影响关键酶表达（Mgat1/GnT-I、Man2a1/Man-II、Mgat2/GnT-II和高尔基体UDP-GlcNAc转运蛋白SLC35A3），分析了四组实验的mRNA水平。ManNAc处理组和对照组之间未观察到显著差异。然而，ManNAc补充组在第7、10和14天的细胞内UDP-GlcNAc浓度显著高于对照组。早期ManNAc组在第7天显示UDP-GlcNAc积累，而晚期ManNAc组在第10天后显示延迟积累。去除ManNAc（第7天后的第3组）使UDP-GlcNAc恢复至基线，证实其对外源ManNAc的依赖性。

这些发现表明UDP-GlcNAc是Man5向G0F糖型酶促转化的关键底物。增加的细胞内UDP-GlcNAc可能通过UDP-GlcNAc转运蛋白SLC35A3运输到高尔基体腔中，参与从Man5到G0F N-聚糖的聚糖成熟过程，从而降低抗体上Man5结构的丰度。

2.4. ManNAc介导的UDP-GlcNAc调控的潜在途径

提出了三种代谢途径来解释UDP-GlcNAc积累：途径1涉及ManNAc通过AGE酶转化为GlcNAc，然后进行磷酸化和UDP添加，但未检测到的AGE mRNA水平排除了该路线；途径2涉及GNE mRNA表达在各组间无变化，排除了转录调控；途径3涉及CMP-Neu5Ac在从UDP-GlcNAc合成ManNAc过程中抑制GNE活性。

代谢分析显示第3天细胞内ManNAc急剧上升，随后下降，与第14天CMP和Neu5Ac分别增加20倍和140倍同时发生。CMP-Neu5Ac通过其水解产物CMP和Neu5Ac确认，因为其在测定处理过程中分解。这表明吸收的ManNAc逐渐转化为唾液酸。

用CHO和E. coli表达的GNE酶进行的体外测定显示，CMP-Neu5Ac浓度≥333 μM使CHO-GNE活性降低≥43%，而≥100 μM CMP-Neu5Ac抑制半数以上E. coli-GNE活性（片段和全长GNE类型）。基于体外抑制研究结果，外源ManNAc可能补偿唾液酸合成，导致UDP-GlcNAc积累和GNE活性反馈抑制，从而增强Man5向G0F转化。

考虑到体外抑制研究在反映CHO细胞实际细胞调控方面可能存在限制，团队还尝试通过磁珠免疫沉淀分离方法研究培养细胞中的体内GNE酶活性。由于GNE在CHO细胞中表达丰度低且抗体特异性/亲和力存在不确定性，获得体内GNE活性数据的困难增加。建立体内GNE活性测定的相应故障排除过程已总结在补充数据中。

3. 讨论

ManNAc有效降低Man5水平，但其潜在机制先前未知。阐明ManNAc的机制将增强我们对高Man5性质的理解，并提供对抗体翻译后修饰的更深入见解。本研究解读了ManNAc降低Man5的机制：ManNAc被细胞摄取，参与唾液酸生物合成途径，产生大量CMP-Neu5Ac。CMP-Neu5Ac抑制GNE酶活性，从而减少UDP-GlcNAc流向ManNAc。因此，更大比例的UDP-GlcNAc流量被导向Man5聚糖链的下游加工，最终导致Man5减少。

细胞外和细胞内ManNAc浓度测量共同证明ManNAc成功进入细胞内区室。然而，ManNAc进入细胞的具体运输机制仍不清楚。过去研究表明在大肠杆菌中，manXYZ操纵子编码磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统糖转运蛋白，能够运输多种碳水化合物包括ManNAc。暴露于有机溶剂可迅速上调大肠杆菌中manXYZ基因表达。上清液中ManNAc的补充水平显著高（推荐20 mM），但其实际细胞消耗仍然有限，表明CHO细胞中可能存在运输效率低下问题。文献证明乙酰化ManNAc衍生物在细胞中表现出比天然ManNAc结构高900倍的代谢效率，尽管其生产成本大幅提高。因此，后续研究应优先鉴定CHO细胞中的ManNAc转运蛋白。增强运输能力可降低所需ManNAc补充浓度，从而优化生物工艺成本效益。

ManNAc提高细胞内CMP-Neu5Ac浓度，但在ManNAc撤除后，CMP-Neu5Ac迅速耗尽。后期培养阶段唾液酸需求增加的根本原因仍不清楚。指数生长期中，快速细胞增殖与高唾液酸需求同时发生，而在稳定期，抗体生产占主导，但抗体相关唾液酸化极少。这就提出了问题：后期培养阶段的唾液酸需求定位在哪里？在哺乳动物细胞中，对粘附、信号传导和蛋白质运输至关重要的聚糖修饰在所有细胞类型中普遍分布。除了常规糖蛋白和糖脂外，膜相关RNA也表现出唾液酸化聚糖修饰。值得注意的是，细胞唾液酸经历动态更新：含有唾液酸的膜成分通过内吞作用被内化，被溶酶体唾液酸酶降解，并部分回收进入唾液酸生物合成途径。此外，我们观察表明ManNAc改善后期培养阶段的细胞活力。研究报道唾液酸化糖蛋白在氧化应激下稳定蛋白质结构。总的来说，这些发现表明后期培养中唾液酸需求增加，ManNAc补偿了UDP-GlcNAc流入唾液酸合成途径的流量。

ManNAc不影响GNE酶的基因表达水平。然而，体外酶活性测定证明CMP-Neu5Ac对GNE酶活性产生负反馈抑制。值得注意的是，使用磁珠免疫沉淀分离方法从正常培养的CHO细胞中提取的GNE酶未检测到活性。相比之下，在相同测定条件下，标准化GNE酶在相同板中表现出保留的酶活性。为进一步确认GNE酶是否从CHO细胞成功提取或提取的酶是否无活性，后续对所有提取蛋白质（未加标和加标GNE标准的细胞裂解物）进行了非还原Western blot分析。结果显示所有免疫沉淀组在60 kDa和75-125 kDa处观察到一致的分子量模式。而阳性对照组中E. coli表达的标准化GNE酶仅在70 kDa处显示清晰条带，CHO表达的标准化GNE酶未检测到信号。第7-11泳道（细胞样品）显示出与目标分子量（70 kDa）不一致的条带。此外，这些非特异性条带也在纯缓冲液对照组中检测到。这些结果共同表明当前GNE抗体缺乏特异性或对CHO表达的GNE酶结合亲和力低。GNE酶很可能未从细胞裂解物中成功提取。正在评估替代抗体以改进特异性用于进一步研究。

除了抗体特异性和亲和力外，GNE多聚体形式也可能增加酶活性结果的不确定性和体内提取的困难。GNE抗体识别的GNE多聚体类型可能无活性，这可能是为什么在细胞裂解物中加标的GNE酶（E. coli表达，经确认具有高酶活性）在免疫沉淀提取后也未检测到的可能原因。文献报道单体GNE/MNK无活性，二聚体形式仅显示MNK活性，而六聚体显示MNK和GNE活性。然而，晶体学研究证明四聚体形式的GNE/MNK保留酶活性，而二聚体形式无催化活性。进一步结构分析显示CMP-Neu5Ac结合在二聚体-二聚体界面，将酶锁定在紧密封闭的构象中，空间限制底物访问，从而抑制其催化功能。未来工作将专注于优化酶提取方案以评估ManNAc处理与未处理细胞中GNE活性变化，从而进一步阐明ManNAc在将UDP-GlcNAc流量从唾液酸生物合成途径分流中的作用。

ManNAc补偿了UDP-GlcNAc流入唾液酸合成途径的流量。然而，由于ManNAc成本高，考虑了通过基因修饰细胞增强总UDP-GlcNAc生产来解决细胞内UDP-GlcNAc不足的可行性。UDP-GlcNAc由葡萄糖通过六步酶促级联合成，涉及多个编码正向和反向酶的基因。进行PCR分析以识别潜在限速步骤。前两个反应作为糖酵解的一部分被排除分析，而随后的四个步骤涉及10个基因被检查。ManNAc补充不改变这些基因的表达水平，所有阈值循环（Ct）值保持在30以下。值得注意的是，某些基因如Gfpt2随着培养时间延长表现出上调表达，表明细胞试图通过上调生物合成途径基因在后期培养阶段增强UDP-GlcNAc供应。已发表研究表明仅2-5%的葡萄糖通过糖酵解进入UDP-GlcNAc。然而，对这些基因进行遗传修饰可能破坏基本碳代谢的担忧促使采取谨慎态度，并推迟进一步研究。此外，由于细胞区室化，UDP-GlcNAc在细胞质中合成并通过SLC35A3转运蛋白运输到高尔基体进行聚糖加工。PCR数据显示ManNAc不诱导SLC35A3表达变化。未来研究可探索过表达该转运蛋白是否可能加速UDP-GlcNAc运输到高尔基体，从而降低Man5水平。

此外，观察到无论ManNAc补充与否，新生抗体的Man5水平随着培养时间延长持续增加。该现象在表达不同靶蛋白的多个克隆中一致观察到。虽然ManNAc增强了UDP-GlcNAc流向N-糖基化的流量，但细胞内代谢物分析显示UDP-GlcNAc浓度随着培养持续时间逐渐增加。对于酶促反应，底物浓度、酶量和活性是关键决定因素。PCR分析证明Mgat1或Mgat2基因表达水平随时间无显著变化。然而，随着培养持续时间延长，细胞内环境的改变可能不利影响酶活性。例如，先前研究表明延长培养时间导致氨浓度升高和渗透压增加，随后提高高尔基体pH。高尔基体pH升高是否损害酶活性仍未解决，需要进一步研究。

总之，本研究阐明了ManNAc降低Man5水平的机制。这些发现表明在后期细胞培养中观察到的Man5水平增加可能源于UDP-GlcNAc底物耗竭。为解决此问题，未来策略可专注于基因工程化代谢途径以增强葡萄糖到UDP-GlcNAc的流量分布，前提是此类修饰不破坏核心碳代谢。该方法具有降低生产成本同时维持治疗性抗体制造中聚糖质量的潜力。

4. 材料与方法

（此部分详细描述了实验材料、细胞系、培养基、培养条件、分析方法、酶表达纯化、活性测定等技术细节，为研究提供了可重复的方法学基础。）