中国西南地区产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌血流感染的分子特征与危险因素分析

　　本综述系统研究了中国西南地区产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）引起的血流感染（BSI），揭示了其分子特征（包括ST分型、血清型及耐药基因分布）并识别出转入院患者、头孢类抗生素使用史及住院时间延长为独立危险因素，对临床防控ESBL-Kpn传播及优化治疗策略具有重要指导意义。

　　

Abstract

Purpose

本研究旨在探讨产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌（ESBL-Kpn）引起的血流感染（BSI）的分子特征及相关危险因素。

Methods

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行细菌鉴定，通过MicroScan WalkAway 96 Plus系统和微量肉汤稀释法评估药物敏感性。利用聚合酶链反应（PCR）检测常见超广谱β-内酰胺酶耐药基因（bla_SHV、bla_TEM、bla_CTX-M）。采用多位点序列分型（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、荚膜血清分型及血清抵抗试验分析菌株分子特征，并通过Logistic回归分析确定ESBL-Kpn引起BSI的危险因素。

Results

从2020年1月至2023年6月共分离出371株肺炎克雷伯菌，其中45株确认为ESBL生产者。共鉴定出28种ST型，以ST15为主。多数菌株呈多重耐药，主要ESBL耐药基因为bla_CTX-M-15。9株菌（20%）表现出高血清抵抗性，27株匹配到荚膜血清型，以K17为主。多变量分析显示，转入院患者、头孢类抗生素使用史及住院时间延长是ESBL-Kpn BSI的独立危险因素。

Conclusion

ESBL-Kpn引起的BSI耐药率高。新发现的ST6835和ST6837表明中国西南地区出现新的克隆传播，强调需加强对产ESBL菌株的监测。

Introduction

肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）属革兰阴性荚膜细菌，是“ESKAPE”病原体之一，可导致肺炎、尿路感染、血流感染和败血症等多种感染性疾病。根据2024年中国细菌耐药监测网（CHINET）报告，其临床分离率仅次于大肠杆菌（E. coli），且在BSI中有超越趋势。该菌具有较厚的多糖荚膜，可增强其抗吞噬能力，提高生存率和致病性。随着分离率上升及多重耐药（MDR）菌株的出现，其防控形势日趋严峻。

β-内酰胺类抗生素（包括青霉素、头孢菌素、单环β-内酰胺类等）是治疗肺炎克雷伯菌感染的主要药物。然而，随着产ESBL肠杆菌科（ESBL-E）感染率和耐药率上升，这些药物的疗效受到严重挑战。ESBL属于Ambler分类中的A类酶，主要包括SHV、TEM和CTX-M型。自发现以来，ESBL已在全球广泛报道。在美国，产ESBL细菌每年导致约26000例耐药感染和1700例相关死亡。世界卫生组织（WHO）在2024年发布的细菌优先病原体清单中将产ESBL细菌列为关键优先级病原体。相关研究表明，ESBL-E感染与较高死亡率、住院时间延长和医疗费用增加相关。由于其质粒介导的传播特性，耐药基因可在人和动物之间传播，显著促进MDR表型的出现。碳青霉烯类药物仍是治疗ESBL感染的主要选择，但不恰当的经验治疗也会导致更高死亡率。因此，迫切需要制定有效的预防和治疗策略。

尽管中国已有大量关于ESBL-Kpn BSI的分子流行病学研究，但西南地区数据仍较缺乏。本研究分析了西南医科大学附属医院BSI患者分离的ESBL-Kpn菌株，描述其分子特征并识别BSI相关危险因素，旨在为医院感染控制及临床管理提供依据。

Materials and Methods

Bacterial Collection

2020年1月至2023年6月，从西南医科大学附属医院BSI患者中分离并鉴定出371株肺炎克雷伯菌，使用MALDI-TOF MS进行鉴定。ESBL表型确认依据CLSI 2023-M100指南进行。

Risk Factor Analysis

以2020–2023年ESBL-Kpn BSI患者为病例组，按1:2比例随机选择非ESBL-Kpn BSI患者作为对照组，收集包括人口学特征、抗生素使用、侵入性操作、合并症、住院时间、临床结局等数据。

Antimicrobial Susceptibility Testing (AST)

使用MicroScan WalkAway 96 Plus系统和微量肉汤稀释法进行药敏试验，测试抗生素包括阿米卡星、氨苄西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、妥布霉素、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁和替加环素。结果判读依据CLSI指南，替加环素参考EUCAST标准。以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株。

Detection of Antimicrobial Resistance Genes

采用煮沸法提取基因组DNA，通过PCR检测bla_SHV、bla_TEM和bla_CTX-M基因。阳性样本送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序，序列在Pasteur数据库进行分析。

Multilocus Sequence Typing (MLST)

采用MLST分析临床分离株的遗传相关性，PCR产物测序后提交Pasteur MLST数据库确定ST型，新序列按需分配新ST。

Pulsed-Field Gel Electrophoresis Analysis

使用XbaI-PFGE分析菌株遗传同源性，条件为18小时电泳，片段范围30–700 kb，数据通过BioNumerics软件分析。

Serum Resistance Testing

将75 μL健康人混合血清与25 μL菌液共培养3小时，在0、1、2、3小时取样稀释涂板，按菌落计数分为6个抵抗等级。以肺炎克雷伯菌ATCC700603和ATCC2044为对照。

Capsule Serotyping by PCR and Sequencing

采用wzi引物进行PCR扩增，阳性产物测序后在Pasteur网站比对确定荚膜血清型。

Statistical Analysis

使用SPSS 26.0进行统计分析。分类变量采用χ2检验或Fisher精确检验，连续变量采用t检验或秩和检验。将单因素分析中P < 0.10且具临床意义的变量纳入多因素Logistic回归模型，以P < 0.05为差异有统计学意义。

Results

Basic Characteristics of the ESBL-Kpn Strains

45株ESBL-Kpn BSI菌株来源于血液科（n=7, 15.6%）、ICU（n=5, 11.1%）、泌尿外科（n=4, 8.9%）、新生儿科（n=4, 8.9%）、血管外科（n=3, 6.7%）等科室。患者中男性26例（57.8%），女性19例（42.2%），年龄范围11天–76岁，平均45±3.73岁，性别间年龄无显著差异。

Antimicrobial Susceptibility Profiles

大部分菌株对多数抗生素耐药。氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑林和头孢呋辛耐药率为100%，氨苄西林/舒巴坦超过90%。复方新诺明、氨曲南和头孢吡肟耐药率超80%。环丙沙星、头孢他啶、左氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦也呈现较高耐药率。头孢西丁、阿米卡星和替加环素耐药率低于10%。

Phenotype and Genotype Analysis

所有45株菌经CLSI确认产ESBL。共检出3种ESBL耐药基因：23株携带bla_TEM，37株携带bla_SHV，36株携带bla_CTX-M，15株同时携带3种基因。主要耐药基因为bla_CTX-M-15（n=14）。

Homology Analysis Results of Clinical Isolates

共鉴定出26种已知ST型，以ST15（n=5, 11.1%）、ST37（n=4, 8.9%）、ST101（n=4, 8.9%）、ST23（n=3, 6.7%）和ST485（n=3, 6.7%）为主。另发现2个新ST型：ST6835和ST6837。PFGE显示相同ST型菌株指纹图高度相似，提示同源且分离时间接近。

Serum Resistance Test

9株（20%）表现为高血清抵抗（5–6级），15株（33.33%）为中度抵抗（3–4级），21株（46.67%）为血清敏感（1–2级）。

Capsular Serotyping Profiles

共鉴定出15种荚膜血清型，主要型别为K17（n=4）、K1（n=3）、K19（n=3）、K18（n=2）、K28（n=3）和K62（n=2），18株未匹配到已知血清型。在27株确定血清型的菌株中，K17均属于ST101，K1属于ST23，K19主要对应ST967和ST15，K18对应ST6837和ST15，K28对应ST485和ST15，K62均对应ST45。

Risk Factors and Multivariate Analysis of ESBL-Kpn BSI

单因素分析识别出转入院患者、胃肠道疾病、近6个月手术史、头孢类抗生素使用及住院时间延长为危险因素。多因素分析显示，转入院患者（OR=2.520, 95% CI 1.071–5.931, P=0.034）、头孢类抗生素使用（OR=2.761, 95% CI 1.112–6.856, P=0.029）和住院时间延长（OR=1.029, 95% CI 1.006–1.052, P=0.013）是ESBL-Kpn BSI的独立危险因素。

Discussion

肺炎克雷伯菌对临床抗菌治疗的威胁日益严重，ESBL-Kpn菌血症具有较高死亡率。本研究首次系统报道了中国西南地区ESBL-Kpn BSI的分子流行病学特征，其检出率（16.7%）低于国内其他研究，但全球流行率差异显著，凸显了加强感染控制的迫切性。

细菌耐药机制主要包括水解酶产生、靶点修饰、膜通透性降低及外排泵过表达。本研究中CTX-M型为主要ESBL，以bla_CTX-M-15为主，与全球监测一致。近期研究显示携带bla_CTX-M-15的肺炎克雷伯菌常与碳青霉烯耐药（CRKP）及高毒力特征相关，值得高度关注。bla_CTX-M-3和bla_CTX-M-14在亚洲地区占主导，而bla_CTX-M-1在欧洲更常见，体现了地理分布差异。

ST15是高风险克隆，常产ESBL或碳青霉烯酶并与医院暴发相关，本研究80%的ST15菌株携带bla_CTX-M，与既往研究一致。ST101与高毒力和耐药性相关，多属K17血清型，本结果予以证实，但未发现其所致死亡率显著升高，可能与样本量小有关。ST23属高毒力克隆群CG23，与K1血清型相关，在亚洲广泛流行。

24株菌表现出中高度血清抵抗，其机制涉及补体、肽聚糖相关脂蛋白等多种因子。本研究血清抵抗率（53.3%）低于其他报告，提示西南地区血流分离株毒力较低。新发现的ST6835和ST6837需引起警惕，防止其传播。

医院内MDR肺炎克雷伯菌BSI与患者健康状况、医疗环境、微生物感染及治疗因素相关。本研究首次明确转入院、头孢类抗生素使用及住院时长为ESBL-Kpn BSI独立危险因素，与近期研究一致。碳青霉烯类虽有效治疗ESBL感染，但盲目使用可能加剧耐药危机。质粒介导的耐药基因传播在患者转移过程中易发生水平转移，凸显合理用药及防控MDR感染的重要性。

预后方面，多数患者临床痊愈出院，3例（6.7%）死亡，死亡率低于全球平均水平，死亡患者多为伴有严重基础疾病的老人和儿童，提示这类人群预后较差。

本研究存在一定局限性：样本量较小，未来需扩大收集并进行系统发育分析；为单中心研究，结果外推性有限，需开展多中心合作以加强西南地区ESBL-Kpn分子流行病学监测。

Conclusion

本研究显示ESBL-Kpn引起的BSI耐药率高，ST15为优势ST型。新发现的ST6835和ST6837为首次报道。耐药基因的存在是导致高水平耐药表型的关键因素。转入院、头孢类抗生素使用史及住院时间延长是ESBL-Kpn BSI的独立危险因素。强调需合理使用抗生素并采取有效感染控制措施以预防ESBL-Kpn BSI及其传播。

Ethics Approval and Consent to Participate

研究经西南医科大学附属医院伦理委员会批准（KY2022267），遵循《赫尔辛基宣言》原则，所有患者或其监护人签署知情同意书。

Author Contributions

所有作者对研究构思、设计、实施、数据获取与分析、论文起草与修订均做出重要贡献，同意投稿并对工作负责。

Disclosure

作者声明无利益冲突。

Data Sharing Statement

研究相关数据可根据合理要求从通讯作者处获取。