新型核壳水凝胶3D模型揭示TRPV4介导的巨噬细胞机械感知与异物巨细胞形成机制

　　本文开发了一种新型异质性藻酸盐-胶原核壳水凝胶3D模型，通过调控基质刚度研究巨噬细胞机械感知与异物巨细胞（FBGC）形成机制。研究发现刚度增强显著促进FBGC形成与F-肌动蛋白（F-actin）生成，且TRPV4离子通道及其N端1-130残基在此过程中起关键作用。RNA-seq分析进一步揭示TRPV4调控炎症、纤维化及机械敏感基因表达，为靶向异物反应（FBR）提供了新策略。

　　

1 引言

生物材料在骨科植入物、心血管手术和再生医学等领域应用广泛，但植入后引发的异物反应（Foreign Body Response, FBR）仍是临床面临的重大挑战。FBR是一种慢性炎症反应，主要表现为巨噬细胞聚集并融合成多核的异物巨细胞（Foreign Body Giant Cells, FBGCs），最终形成纤维化包裹，导致植入物功能失效。尽管巨噬细胞在FBR中的核心作用已被广泛认可，但调控FBGC形成的分子机制尚不明确，且缺乏有效治疗策略。

传统二维（2D）细胞培养模型难以模拟体内三维（3D）微环境的机械和生化特性，限制了其对细胞行为的真实反映。近年来，3D培养技术因其能更好地模拟组织架构而受到关注。本研究通过微流控技术构建了一种异质性藻酸盐-胶原核壳水凝胶3D模型，通过调节藻酸盐浓度实现基质刚度（1 kPa模拟正常组织，8-50 kPa模拟纤维化组织）的精确控制，为研究巨噬细胞在仿生环境中的行为提供了新平台。

2 结果

2.1 构建可变刚度的异质性藻酸盐-胶原核壳3D水凝胶微胶囊

研究团队利用非平面微流控装置（图1A-B），通过三通道设计（矿物油、藻酸盐、胶原-藻酸盐混合液）成功制备了核壳结构微胶囊。外壳为纯藻酸盐水凝胶，核心为藻酸盐-胶原混合凝胶并包裹小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）（图1C）。微胶囊核心尺寸为335.1±24.3 μm，总尺寸为466.1±13.7 μm（图1D）。通过原子力显微镜（AFM）和流变学分析证实，2%藻酸盐微胶囊的刚度是0.5%藻酸盐微胶囊的10倍（图1E-F），且刚度在17天内保持稳定（图S2）。该模型成功模拟了纤维化组织的3D结构特性（图1G）。

细胞活性实验表明，软硬微胶囊均能支持BMDMs存活，且在IL4和GMCSF（25 ng mL^?1）诱导下细胞活性维持良好（图1H-J），证明该模型适用于长期体外研究。

2.2 刚性核心3D模型精准模拟体内FBGC形成特征

在野生型（WT）BMDMs中，刚性微胶囊显著促进FBGC数量和体积的增加（图2A-C），且IL4和GMCSF处理进一步放大这一效应（图2D-F）。与2D培养相比，3D模型在FBGC核数量（12 vs 26）、细胞大小（40 μm vs 70 μm）和形成时间（17天 vs 6天）方面更接近体内数据（28天，10核，50 μm）（图3A-D）。这表明3D模型在模拟体内微环境方面具有显著优势。

2.3 TRPV4通过机械感知调控肌动蛋白聚合与FBGC形成

TRPV4缺失（KO）的BMDMs在刚性微胶囊中表现出FBGC形成和F-actin生成减少（图4A-C）。药理学抑制TRPV4（GSK2193874处理）同样抑制了FBGC形成和F-actin组装（图4D-F），证实TRPV4在机械信号转导中的核心作用。IL4和GMCSF处理在WT细胞中强化了这一效应，但在TRPV4 KO细胞中无效，表明TRPV4是生化与机械信号交叉调控的关键节点。

2.4 TRPV4的N端1-130残基是FBGC形成的关键结构域

通过腺病毒载体表达TRPV4 N端缺失突变体（Δ1-30, Δ1-130, Δ100-130）发现，缺失1-130残基完全抑制了FBGC形成和F-actin生成（图5A-D），而Δ1-30和Δ100-130也导致部分功能丧失。这表明N端结构域（尤其是1-130区域）对TRPV4的机械感知功能至关重要。

2.5 TRPV4调控炎症、纤维化与机械敏感基因表达

RNA-seq分析鉴定出1143个差异表达基因（DEGs），其中TRPV4 KO细胞中393个基因上调，750个下调（图6A-C）。关键炎症基因（MMP2, MMP8, MMP9, TLR4）、纤维化基因（CTGF, Col1a1, Col3a1）和机械敏感基因（Piezo1, TRPM7, Vinculin）均显著下调（图6B, 7A-E）。GO和KEGG分析显示，这些基因富集于细胞粘附、ECM组织、PI3K-AKT信号和TGF-β通路（图8A-D），表明TRPV4通过多途径协调FBR进程。

3 讨论

本研究开发的3D核壳水凝胶模型在模拟体内FBGC形成方面展现出显著优势，其时间动态、细胞形态和分子响应均更接近生理条件。TRPV4被证实为调控刚度敏感型FBGC形成的核心分子，其N端结构域是关键功能区域。下游基因调控网络进一步揭示了TRPV4在炎症、纤维化和机械信号整合中的核心作用。

该模型为生物材料相容性评价提供了新工具，并提示靶向TRPV4可能成为缓解FBR的新策略。未来研究需引入多种细胞类型（如成纤维细胞、内皮细胞）以更好模拟体内微环境，并通过单细胞测序进一步解析巨噬细胞异质性。

4 实验方法

研究使用C57BL/6野生型和TRPV4 KO小鼠，通过M-CSF诱导获得BMDMs。微流控设备通过SU-8光刻和PDMS翻模制备，藻酸盐-胶原微胶囊通过钙离子交联固化。细胞活性通过Calcein AM/PI染色评估，FBGC通过Phalloidin（F-actin）和DAPI（核）染色量化。AFM用于刚度测量，RNA-seq和qPCR用于基因表达分析，数据通过GraphPad Prism进行统计学处理。

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推荐说明：

本文通过创新性核壳水凝胶3D模型，揭示基质刚度与TRPV4离子通道协同调控巨噬细胞融合及异物巨细胞（FBGC）形成的机制，为靶向异物反应（FBR）提供了新视角与实验平台。