工程化益生菌通过分泌PCSK9纳米抗体与调节肠道菌群改善高脂血症和动脉粥样硬化的作用与机制研究

　　本研究发现一种基于大肠杆菌Nissle 1917（EcN）的工程化益生菌株（EcN/PCSK9nb），能够高效分泌PCSK9纳米抗体（PCSK9nb），通过口服给药显著降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平、减轻动脉粥样硬化病变，并调节肠道菌群结构。该研究为开发口服型PCSK9抑制剂提供了新策略，具有重要的临床转化潜力。

　　

工程化益生菌的构建与表征

研究团队通过密码子优化获得了人源PCSK9纳米抗体VHH-B11的序列，并将其与四种不同信号肽（NSP4、dsbA、pelB、phoA）组合，构建了重组质粒pUC19-tac-信号肽-PCSK9nb。Western blot分析表明，携带NSP4信号肽的工程菌EcN/PCSK9nb能够最有效地将PCSK9nb分泌至培养上清液中。透射电镜显示工程菌形态未发生改变，生长曲线与野生型EcN无显著差异，表明外源基因的导入未影响细菌的基本生理特性。

PCSK9nb的表达与功能验证

Co-IP实验证实，EcN/PCSK9nb分泌的PCSK9nb能够特异性结合小鼠PCSK9蛋白。通过ELISA检测发现，多次灌胃（每周3次）可在小鼠血清中维持较高的PCSK9nb水平，而单次给药后3天即降至基线水平，说明需定期给药以维持疗效。

工程菌的体内分布与耐受性

灌胃EcN/PCSK9nb后，通过粪便菌落计数及PCR鉴定，发现工程菌在肠道内可存活约4天，第4天菌量降至10⁵ CFU/g以下。体外模拟胃液和胆汁盐耐受实验表明，工程菌在1–1.5小时内能保持活性。免疫荧光染色显示，PCSK9nb在肠道（空肠、回肠、结肠）及肝、脾、肺、肾等组织中均有分布，证实其能够穿越肠屏障进入循环系统。

改善高脂饮食诱导的高脂血症

在高脂饮食（HFD）喂养的C57BL/6J小鼠模型中，EcN/PCSK9nb干预组体重增长显著减缓，血清总胆固醇（CHOL）和LDL-C水平明显降低，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）也有所下降。同时，血清炎症因子IL-1β、CRP和LPS水平显著降低，表明系统炎症反应得到缓解。

减轻动脉粥样硬化病变

在ApoE^?/?小鼠动脉粥样硬化模型中，EcN/PCSK9nb处理显著降低了主动脉根部和全主动脉的粥样斑块面积（减少约20%），血清LDL-C水平下降，但HDL-C无显著变化。Oil Red O染色显示肝脏脂质积累明显减少，H&E染色进一步证实肝细胞脂滴数量和体积减小。

机制探究：LDLR上调与炎症缓解

Western blot分析显示，EcN/PCSK9nb处理组小鼠肝脏LDL受体（LDLR）表达水平升高。RT-qPCR结果表明，肝脏中炎症相关基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1）的mRNA表达显著下调，说明PCSK9nb通过中和PCSK9、保护LDLR功能，进而促进脂质代谢并减轻炎症反应。

调节肠道菌群结构

16S rRNA测序分析显示，EcN/PCSK9nb干预改变了HFD小鼠的肠道菌群结构。PCoA分析表明工程菌处理组菌群结构与其他组存在明显差异。在门水平上，Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值下降（从3.03降至1.36），该比值与肥胖和代谢紊乱呈正相关。在属水平上，Lachnoclostridium、Anaerotruncus和GCA-900066575等有益菌成为优势菌群，提示菌群结构的改善可能与代谢益处相关。

与阿托伐他汀的疗效对比

在与临床常用降脂药阿托伐他汀的对比实验中，EcN/PCSK9nb显示出与之相近的降脂效果：两者均能显著降低体重、肝脏脂质积累和血清LDL-C水平。不同的是，阿托伐他汀还降低了HDL-C，而工程菌对HDL-C影响较小，提示其可能具有更好的血脂调节安全性。

讨论与展望

本研究成功构建了可口服的工程菌EcN/PCSK9nb，证实其可通过分泌PCSK9nb有效降低血脂、减轻动脉粥样硬化，并调节肠道菌群。尽管工程菌在小鼠肠道内定植时间较短，需多次给药，但其低成本、易生产、良好的生物相容性以及潜在的多重益生功能（如免疫调节、抗菌活性）为其临床转化提供了优势。未来研究可着眼于提高抗体分泌效率、增强肠道定植能力，并探索基于其他底盘菌（如拟杆菌）的递送系统，以推动口服纳米抗体药物的开发。