人iPSC来源ADHD皮质神经元揭示谷氨酸能发育失调及其病理机制研究

　　本研究利用人诱导多能干细胞(hiPSC)技术构建ADHD皮质神经元模型，首次发现患者来源神经元存在谷氨酸能发育异常：vGLUT2转录显著降低约50%，EAAT2表达下降，钙成像显示突触信号强度与频率减低，提示神经元低活性表型。该模型为ADHD药物筛选提供了可靠细胞表型，表明谷氨酸能系统应成为未来治疗靶点。

　　

注意力缺陷多动障碍（ADHD）是一种常见的慢性神经发育障碍，以注意力不集中、多动和冲动为核心症状，严重影响患者的生活质量和预期寿命。尽管ADHD是遗传度最高的神经精神疾病之一，但其病因仍不明确，这严重阻碍了新药的开发。传统研究主要集中于多巴胺能和去甲肾上腺素能系统，并依赖动物模型，但越来越多的证据表明谷氨酸能系统在ADHD病理机制中扮演重要角色，同时动物模型与人类临床试验之间存在转化鸿沟。

近年来，基因组学研究发现ADHD风险基因在兴奋性神经元中富集表达，特别是在前额叶皮层，这提示皮层谷氨酸能神经元功能异常可能是ADHD的关键病理基础。此外，神经影像学研究也发现ADHD患者皮层厚度和表面积减少，表明显著的神经发育延迟。然而，由于缺乏直接的人类神经元模型，这些发现尚未在细胞水平得到验证。

为此，研究人员选择人诱导多能干细胞（hiPSC）技术，通过重编程成人皮肤成纤维细胞获得多能干细胞，进而定向分化为皮质神经元（CNs），从而在体外模拟人类神经发育过程。这一方法不仅能够保留供体的遗传背景，还能避免物种差异，为研究高度遗传性、多基因疾病如ADHD提供了前所未有的细胞模型。

本研究利用hiPSC技术，成功建立了来自健康对照和成年ADHD患者的功能性皮质神经元模型，并系统评估了其神经发育、谷氨酸能信号传导及突触功能。研究发现，尽管AD患者hiPSC能够正常分化为皮质神经元，但其成熟过程受到抑制，表现为神经元成熟标志物NEUN转录和蛋白表达下降，细胞外谷氨酸动态异常，vGLUT2转录持续显著降低，且钙信号显示神经元活性减弱。这些结果不仅揭示了ADHD中谷氨酸能系统发育失调的细胞表型，也为后续药物筛选和靶点验证提供了重要平台。该研究发表于《Molecular Psychiatry》。

研究人员采用了几项关键技术方法：使用Sendai病毒重编程成人皮肤成纤维细胞获得hiPSC并进行多能性质检；通过小分子诱导实现双SMAD抑制，分化为神经前体细胞（NPCs）并进一步成熟为皮质神经元；利用免疫荧光（IF）和Western blot检测细胞类型标志物（如PAX6、SOX2、TUBB3、vGLUT2、PSD95）的表达与定位；通过RT-qPCR分析关键基因转录水平；采用钙成像动态监测神经元自发电活动；并使用酶学方法测定细胞外谷氨酸和谷氨酰胺浓度。样本来源于4例健康对照和7例ADHD成人患者。

Optimisation and characterisation of hiPSC-derived cortical neuron model

研究人员成功建立了hiPSC来源的皮质神经元分化体系，该模型可形成功能成熟的谷氨酸能神经元。Western blot显示，随着分化进行，PAX6蛋白表达显著下降而vGLUT2表达上升，表明神经发生和谷氨酸能发育的正常进程。免疫荧光证实12周龄神经元表达成熟神经元标志物MAP2、NEUN、vGLUT2以及突触标记vGLUT1与PSD95，且二者共定位提示功能性谷氨酸能突触形成。细胞外谷氨酸和谷氨酰胺浓度随成熟显著增加，钙成像显示自发性钙信号强度和频率随时间增强，表明神经元具备自发突触传递功能。

Differentiation capacity of hiPSCs derived from HCs and ADHD patients

ADHD患者来源hiPSC在分化为神经前体细胞（NPCs）和早期皮质神经元时表现正常，PAX6、SOX2阳性细胞比例及TUBB3蛋白表达与对照组无差异，表明基础神经分化能力未受损。然而，在12周成熟神经元中，尽管NEUN阳性细胞比例无差异，但其荧光强度和转录水平均显著降低，提示ADHD神经元存在成熟障碍。

Differences in glutamatergic development

健康对照组神经元在成熟过程中细胞外谷氨酸浓度显著上升，而ADHD组则无此变化。基因表达分析显示，患者神经元中vGLUT2转录水平下降约50%，EAAT2（主要谷氨酸转运体）转录也显著降低，PSD95和vGLUT1虽有下降趋势但未达显著性。发育时序分析发现，vGLUT2转录在ADHD神经元中随时间进展而下降，与对照组上升趋势相反，且在4周和12周时均显著低于对照，表明谷氨酸能发育路径异常。

Functional effects on glutamatergic synaptic signalling

钙成像分析显示，ADHD神经元在8、10、12周均表现出降低的钙信号峰值振幅（指示信号强度减弱）和显著减少的钙峰频率（指示神经元活动度下降），表明ADHD皮质神经元存在功能性低活性表型。

研究结论表明，ADHD患者来源的皮质神经元表现出明显的神经发育延迟和谷氨酸能系统功能紊乱。vGLUT2转录大幅减少可能直接导致谷氨酸释放不足，进而引起细胞外谷氨酸平衡失调、EAAT2表达下降以及突触信号减弱。这一稳定的细胞表型（~50% vGLUT2下降）可作为ADHD药物筛选的理想内在表型。此外，本研究支持前额叶皮层谷氨酸能信号 hypoactivity（低活性）作为ADHD的核心病理机制，为针对谷氨酸能系统的药物开发（如调节谷氨酸释放或受体功能）提供了直接证据。尽管研究存在样本量较小、模型为2D培养等限制，但这一hiPSC模型成功填补了动物模型与临床研究之间的转化空白，为理解ADHD病理机制和开发新治疗策略提供了重要平台。