法尼罗醇通过抑制PI3K-AKT/MAPK通路改善炎症性肠病相关骨质疏松的机制研究

　　本研究揭示天然化合物法尼罗醇（FA）通过调节肠道菌群-短链脂肪酸（SCFAs）轴，抑制PI3K-AKT/MAPK信号通路活化，从而缓解炎症性肠病（IBD）相关的骨质疏松（OP）。实验表明FA可改善结肠炎症、修复肠道屏障，并直接抑制破骨细胞分化和骨吸收功能，为IBD继发OP的治疗提供了新策略。

　　

Highlight

UC小鼠表现出骨量减少和破骨细胞生成增加

通过孟德尔随机化分析（MR分析），我们利用全基因组关联数据探索了IBD与骨质疏松（OP）的关联。异质性检验中，IVW法的MR-Egger结果显示SNP=56，比值比[OR]（95%置信区间[CI]）=1.033817583，P值=0.02798212，表明IBD与OP存在因果关系（图1A）。散点图显示IBD与OP呈正相关（图1B）。此外，漏斗图和留一法分析均支持结果的稳健性（图1C-D）。

FA使UC小鼠肠道菌群恢复正常并改变微生物多样性

由于15 μM剂量的FA对改善UC小鼠骨丢失效果不足，后续实验选用30 μM剂量。为阐明FA通过肠-骨轴影响骨质疏松的机制，我们收集小鼠粪便进行16S rRNA测序以评估肠道微生物群落变化。PCA分析表明，在操作分类单元（OTU）水平上，DSS组与CTRL组区分明显，而FA组与CTRL组接近且交叉（图2A）。群落柱状图显示，在门水平上，DSS组拟杆菌门（Bacteroidota）减少而厚壁菌门（Firmicutes）增加，FA干预后两者比例趋于正常（图2B）。LEfSe分析进一步鉴定出各组特异性菌群（图2C-D）。

FA调节炎症因子表达并改善粪便SCFAs与肠道完整性

FA可能通过调节UC小鼠肠道菌群代谢物影响骨量，因此我们检测了各组粪便中短链脂肪酸（SCFAs）含量。与CTRL组相比，UC小鼠丙酸、异戊酸、异丁酸、丁酸、戊酸和乙酸水平显著降低，其中丙酸、异戊酸和异丁酸下降尤为明显。FA治疗后SCFAs含量回升（图4A）。正常小鼠结肠HE染色显示结构完整，而UC小鼠黏膜层炎性细胞浸润、杯状细胞减少且隐窝结构破坏；FA干预后炎症减轻且结构部分修复（图4B）。免疫组化显示UC小鼠结肠Occludin和ZO-1表达下降，FA治疗后表达回升（图4C）。ELISA检测血清炎症因子显示，UC小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，FA治疗后显著降低（图4D）。

RNA测序揭示FA下调UC小鼠破骨细胞基因表达及相关通路

我们从UC小鼠和药物处理组小鼠提取骨髓巨噬细胞（BMMs），经RANKL诱导后行RNA测序以分析转录组变化。共鉴定出2864个差异表达基因，其中1517个下调、1347个上调（图5A）。GO富集分析表明差异基因参与炎症反应调控（图5B）。KEGG分析显示基因富集于破骨细胞分化、PI3K-AKT和MAPK信号通路（图5C）。热图进一步展示FA对破骨细胞标志基因（如Nfatc1、Ctsk、Acp5）的抑制作用（图5D）。

FA抑制RANKL和LPS诱导的炎症性破骨细胞生成及骨吸收功能

为模拟肠炎小鼠体内炎症环境，我们采用LPS探究FA对RANKL刺激下破骨细胞形成的影响。CCK-8试验显示FA（30 μM）和LPS（100 ng/mL）对BMMs无细胞毒性（图6A）。TRAP染色表明FA浓度依赖性地抑制RANKL+LPS诱导的破骨细胞形成（图6B-C）。骨吸收实验显示FA显著减少破骨细胞性骨陷窝面积（图6D-E）。

FA抑制炎症性破骨细胞特异性基因及炎症因子表达

qPCR检测显示，RANKL和LPS上调了破骨细胞标志基因（Ctsk、Nfatc1、c-FOS、Atp6v0d2、Mmp9、Traf6）的表达，而FA干预逆转了这一趋势（图7A）。免疫荧光显示NFATc1核转位在RANKL+LPS刺激下增强，FA处理后其核定位显著抑制（图7B-C）。Western blotting进一步证实FA降低NFATc1和c-FOS的蛋白表达（图7D-E）。

FA抑制OC分化过程中PI3K-AKT和MAPK信号通路的转导

为深入探究FA抑制破骨细胞形成的机制，我们研究了FA添加后测序富集到的破骨细胞相关通路、MAPK和PI3K-AKT通路的变化。Western blotting显示（图8A-B），FA在RANKL+LPS刺激后5、10、30、60分钟显著抑制p-PI3K（图8C），5分钟抑制p-AKT（图8D），5、10、20、30、60分钟抑制p-GSK3β（图8E）。FA还抑制MAPK通路关键蛋白p-P38、p-ERK和p-JNK的磷酸化（图8F-H）。

Discussion

当前COVID-19病毒持续变异传播，导致反复感染，患者急性感染治愈后出现长期不典型后遗症，严重影响生活质量（Lippi et al., 2023）。COVID-19改变肠道菌群，减少部分有益菌并增加炎症因子，且这种状态可能在康复后持续存在（Lang, 2024）。长期慢性肠道炎症状态下，破骨细胞过度活化导致骨吸收加剧，进而引发骨质疏松。本研究通过体内外实验证明，FA通过多靶点干预IBD相关的骨质疏松：一方面调节肠道菌群组成、增加SCFAs生成、修复肠道屏障并降低系统性炎症；另一方面直接抑制PI3K-AKT和MAPK通路活化，阻断NFATc1核转位，从而抑制破骨细胞分化和骨吸收功能。这为开发基于天然化合物的IBD继发OP治疗策略提供了理论依据。