超声引爆活性氧的铁载体-声敏剂纳米偶联物通过铁死亡样死亡根除细菌生物膜感染

　　本研究针对多药耐药细菌生物膜感染的临床难题，创新性地开发了首例铁载体-声敏剂偶联纳米系统FSP。通过将儿茶酚铁载体与声敏剂Purpurin 18共价连接并自组装铁离子，构建了具有pH响应特性的纳米铁霉素。该系统利用细菌铁摄取系统实现精准靶向，经超声激活同步触发声动力反应和声芬顿反应，产生爆发性活性氧(ROS)并诱导铁死亡样细菌死亡。研究证实该平台可实时定位感染灶并通过多模态成像指导治疗，在小鼠多药耐药铜绿假单胞菌生物膜引起的脓性肌炎模型中实现完全治愈，为抗生物膜治疗提供了突破性策略。

　　

在抗菌药物管理面临严峻挑战的当下，多药耐药细菌的快速出现使传统抗生素疗效大打折扣，而生物膜的形成更是让情况雪上加霜。这些高度组织化的微生物群落通过细胞外聚合物基质包裹细菌集群，形成坚固的物理化学屏障，有效抵御抗菌药物的攻击。更棘手的是，生物膜微环境的特殊性——如低pH值和过氧化氢水平异常——进一步限制了药物效果。与此同时，新型抗生素研发，特别是针对革兰氏阴性菌的抗生素开发几乎陷入停滞。随着抗生素研发管线的日益枯竭，探索替代性治疗范式已成为当务之急。

铁载体介导的"特洛伊木马"策略提供了一种有前景的解决方案。铁载体是细菌为获取铁而分泌的铁螯合代谢物。通过将抗生素与天然铁载体或合成类似物共价连接，形成的杂交体被称为铁霉素，能够劫持细菌铁摄取系统，促进抗生素跨细胞膜的主动运输，有效诱骗细菌自我毁灭。这种靶向递送机制成功 revitalize 现有抗生素，在某些情况下使其细胞内积累增加，最低抑菌浓度降低100倍以上。迄今为止，铁霉素领域已取得显著进展，如头孢地尔(Fetroja?)——一种头孢菌素-铁载体偶联物，于2019年获得临床批准用于治疗复杂性尿路感染。然而，铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性菌中对这些偶联物出现的耐药性揭示了一个根本性局限——它们仍然依赖于抗生素部分，而其有效性易受进化性耐药机制的影响。

与传统抗生素不同，声敏剂通过超声激活的声动力过程产生活性氧(ROS)，引入了一种无耐药性的抗菌管理方式。这些杀菌性ROS对生物膜基质和嵌入的病原体均能造成广谱的结构和功能损伤，同时诱变风险较低。这种规避耐药性的内在能力使声敏剂成为革命性的抗菌替代品。当与铁载体偶联时，这种超声激活的铁霉素类似物有望通过解决两个关键限制而超越抗生素衍生的对应物：偶联后生物活性受损和细胞内药物释放效率低下。此外，声敏剂-铁载体偶联物的治疗潜力可能通过ROS-铁协同作用显著增强，其中铁载体介导的铁积累与声动力产生的ROS协同作用，引爆铁死亡样细菌杀死——一种铁依赖性脂质过氧化级联反应，导致程序性细胞死亡。此外，声敏剂固有的光学特性有利于集成诊疗应用。鉴于这些引人注目的优势，声敏剂-铁载体偶联物可能代表了一类极具前景的下一代铁霉素，但迄今为止，首个范例仍在期待中。

在这项发表于《Bioactive Materials》的研究中，研究人员开创性地通过儿茶酚铁载体与声敏剂purpurin 18的共价连接，随后与铁离子配位自组装形成纳米级铁霉素，构建了首个无载体的铁-铁载体-声敏剂纳米平台FSP。该设计实现了超声引爆的活性氧生成和铁死亡样放大。利用细菌特异性的铁载体摄取和pH响应性组装/解组装特性，纳米铁霉素实现了声敏剂向细菌内的精准递送和主动内化。这一策略允许通过同步荧光/光声和磁共振成像实时定位感染部位。在超声照射下，声敏剂介导的声动力治疗和铁载体/铁增强的声芬顿催化的双重抗菌机制被同时释放，协同触发爆炸性ROS爆发和有效的铁死亡样细菌死亡。最终，患有多药耐药生物膜诱导脓性肌炎的小鼠被完全治愈。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过酰胺偶联合成铁载体-声敏剂偶联物SP18，并通过铁配位自组装制备FSP纳米颗粒；利用透射电子显微镜和动态光散射表征纳米颗粒形貌和尺寸分布；通过紫外-可见-近红外光谱和荧光光谱分析光学特性；使用密度泛函理论计算能级结构；采用分子动力学模拟阐明自组装机制；通过结晶紫染色和菌落形成单位测定评估抗菌效果；借助共聚焦显微镜观察生物膜穿透能力；利用RNA测序和实时荧光定量PCR分析基因表达谱；建立小鼠脓性肌炎模型进行体内疗效评价。

2.1. FSP纳米铁霉素的制备与表征

通过儿茶酚铁载体与purpurin 18的酰胺偶联合成SP18偶联物，随后与铁离子配位自组装形成FSP纳米颗粒。透射电镜显示FSP呈球状形态，动态光散射显示pH依赖性组装/解组装行为。在正常生理条件下(pH=7.4)，FSP纳米铁霉素的平均直径约为100纳米，而在酸性生物膜条件下(pH=5.5)解组装为约5纳米组分。紫外-可见-近红外光谱显示P18在410纳米和550纳米处的特征吸收峰，纳米颗粒形成后近红外区域从710纳米红移至730纳米，表明分子聚集。荧光研究显示在pH=7.4时完全猝灭(聚集状态)，在pH=5.5时信号恢复(解组装状态)。光声成像显示聚集状态(pH=7.4)的信号增强。磁共振成像显示FSP作为T₂加权MRI对比剂的巨大潜力。

2.2. FSP纳米铁霉素的US引爆ROS生成潜力

采用对苯二甲酸作为检测探针评估•OH生成能力，FSP与H₂O₂组合诱导TAOH荧光显著增加，表明•OH生成增强。电子顺磁共振谱进一步验证了US照射下FSP增强的•OH生产。使用9,10-二甲基蒽作为荧光探针评估¹O₂生成能力，FSP与US组合导致显著荧光漂白，证实通过P18介导的声动力反应有效产生¹O_{2。密度泛函理论计算显示Fe-SP18的HOMO-LUMO能隙(ΔE)显著减小，合理化其优异的ROS生成效率。}

2.3. FSP纳米铁霉素的自组装机制

分子动力学模拟表明，π-π堆积和氢键以及铁与SP18之间的金属螯合是驱动FSP组装的主导力。根均方偏差分析显示系统在85纳秒后稳定，确认成功自组装。SP18与铁之间的平均距离约为1.9埃。溶剂可及表面积监测显示从280埃²急剧下降至40纳秒后的稳定平均值120埃²，与疏水相互作用驱动FSP簇集一致。

2.4. 体外抗生物膜和抗菌活性

选择临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，革兰氏阳性)和多药耐药铜绿假单胞菌(MDR PA，革兰氏阴性)作为代表性病原体评估FSP纳米铁霉素的抗生物膜功效。结晶紫染色显示，US激活的FSP组表现出优异的抗生物膜性能。虽然P18对MRSA生物膜的活性优于MDR PA，但FSP纳米铁霉素对MDR PA生物膜表现出 exceptional 敏感性。共聚焦激光扫描显微镜显示FSP具有 exceptional 的生物膜穿透能力。菌落形成单位测定显示US激活的FSP处理将细菌活力降低至MRSA为36.47%，MDR PA为6.47%。活/死荧光染色和扫描电镜观察证实了FSP的强大声杀菌活性。

2.5. 体外抗菌机制

使用2′,7′-二氯二氢荧光素探针评估ROS水平，FSP与US组合进一步增强了ROS生产。细菌铁含量测量证实FSP处理后细胞内Fe²⁺显著积累。脂质过氧化水平在FSP+H₂O₂+US组达到峰值。丙二醛实验显示膜脂质过氧化逐步增加。氧化型谷胱甘肽/GSH比率显著增加，表明GSH耗竭和GSH-GSSG氧化还原平衡破坏。US增强的铁死亡显著抑制了细菌呼吸链。RNA-seq分析显示氧化呼吸链、谷氨酸代谢、谷胱甘肽过氧化物酶和半胱氨酸代谢相关基因下调，而柠檬酸循环、丙酮酸代谢、糖酵解途径和谷氨酸代谢相关基因上调。

2.6. FSP纳米铁霉素的体内脓性肌炎诊断

建立小鼠MDR PA生物膜诱导的脓性肌炎模型，通过尾静脉注射后监测FSP的诊断性能。荧光成像显示不同的生物分布模式，FSP表现出明显不同的药代动力学。离体荧光成像显示感染肌肉组织中FSP保留最高。光声成像 corroborated 荧光成像的发现，显示细菌感染大腿中时间依赖性的FSP积累。磁共振成像在注射后6小时显示明显的对比增强，感染区域在T₁和T₂加权成像上分别呈现正对比和负对比。

2.7. FSP纳米铁霉素的体内脓性肌炎治疗

评估FSP在小鼠MDR PA诱导的脓性肌炎模型中的治疗效果。代表性MRI图像显示，生理盐水或US单独使用都不能缓解感染进展，而FSP与US组合实现了完全脓肿 resolution。血液学分析显示，与对照组相比，FSP治疗组中促炎细胞群显著减少。组织病理学评估显示，FSP+US治疗组的肌肉切片显示正常组织结构的完全恢复，没有残留炎症或组织损伤的证据。免疫荧光成像显示治疗依赖性的PA定植模式，FSP+US组合治疗实现了近乎完全的病原体 eradication。酶联免疫吸附测定测量显示，FSP+US组的血清IL-6和TNF-α水平显著降低。

2.8. FSP纳米铁霉素的生物安全性

MTT测定显示优异的细胞相容性，人脐静脉内皮细胞和NIH 3T3成纤维细胞在FSP暴露后保持>90%活力。血液相容性测试显示在治疗浓度20μM时仅1.53%溶血，显著低于临床可接受性的5%阈值。体内评估显示与PBS处理的对照组相比，全血计数和血清生化标志物没有显著改变。主要器官的组织病理学检查显示FSP没有改变器官的正常解剖结构。

本研究开创了一种变革性的诊疗纳米铁霉素FSP，它将无创多模态成像与超声引爆的ROS放大和铁死亡样细菌杀死相结合，以根除MDR生物膜感染。通过将儿茶酚铁载体与purpurin 18偶联并将铁配位成无载体自组装纳米铁霉素，实现了四个突破性进展：首创设计——作为第一个铁载体-声敏剂偶联纳米系统，FSP消除了抗生素依赖性，同时利用细菌铁摄取机制进行靶向递送；时空控制的ROS风暴——超声同步激活P18介导的声动力反应和铁载体介导的声芬顿反应，导致爆炸性 intra细菌ROS爆发；铁死亡样细菌根除——铁超载与ROS风暴协同作用，引爆细菌铁死亡样杀死，通过实时MRI验证完全消除体内MDR PA生物膜；诊疗一体化——pH响应性组装/解组装特性使FSP能够有效细菌内化，而固有荧光/光声/MRI信号允许精确感染定位。凭借已证明的生物安全性和在难治性脓性肌炎中完全生物膜根除，这项工作建立了一个前瞻性的无抗生素声学平台，用于时空控制的抗菌诊疗，可能改变当前抗菌管理中抗生素主导的范式。