基于天然质谱技术的小分子筛选策略：靶向RNA适体的创新药物发现研究

　　本研究针对RNA靶向药物开发中缺乏高效生物物理筛选方法的难题，采用天然质谱(nMS)技术建立了RNA适体与小分子相互作用的分析平台。通过分析氨基糖苷类RNA适体与配体的结合特性，成功实现了结合强度半定量测定和新型结合剂发现，为RNA靶向药物筛选提供了重要的正交技术方案。

　　

在药物研发领域，蛋白质一直是主要的药物靶点，但随着首款完全合成的小分子药物risdiplam（2020年批准）靶向非核糖体RNA的成功，靶向RNA的药物开发迎来了新的机遇。然而，与蛋白质相比，RNA具有更有限的一级和二级结构特征，识别特异性药物样小分子面临更大挑战。目前针对RNA靶点的筛选方法包括亲和质谱、荧光分析、微阵列筛选和DNA编码化合物库技术等，但仍需要改进分析方法，特别是直接生物物理方法来实现靶向筛选流程。

在这项发表于《Bioorganic Chemistry》的研究中，研究人员探索了天然质谱(native mass spectrometry, nMS)技术在RNA适体小分子筛选中的应用。RNA适体是RNA类型的一个子集，包含短的核苷酸单链序列，可折叠成明确稳定的三维结构，优化后能够与特定小分子配体（其同源配体）结合。虽然nMS已被用于表征RNA-小分子复合物，但尚未常规应用于针对RNA靶标的化合物库筛选。

为了建立可靠的nMS筛选工作流程，研究人员选用了两种氨基糖苷类RNA适体作为模型系统：妥布霉素RNA适体和卡那霉素B RNA适体。这些适体具有明确的序列和已知的配体结合特性，是研究结构化RNA与药物样小分子相互作用的理想模型。

研究采用的主要技术方法包括：天然质谱分析技术(nMS)，使用Q-Exactive Ultra High Mass Range混合四极杆-Orbitrap质谱仪进行正负离子模式检测；样品制备采用250 mM醋酸铵(NH₄OAc)缓冲体系(pH 6.5)维持RNA天然结构；结合实验通过将RNA适体与不同浓度配体孵育后直接进样分析；数据处理采用UniDec软件进行去卷积处理和内部Python脚本可视化分析。

3.1. nMS分析RNA适体和同源配体

研究人员首先对两种氨基糖苷类RNA适体进行了详细表征。妥布霉素RNA适体为27聚体，分子量8670 Da，而卡那霉素B RNA适体为22聚体，分子量7030 Da。有趣的是，nMS分析发现卡那霉素B适体在实验条件下以二聚体形式存在，这一发现通过多种变性条件验证均无法解离。

通过正负离子模式nMS分析，研究人员证实了两种适体与其同源配体的特异性结合。妥布霉素适体主要观察到4+电荷态(m/z=2167.8192)，加入配体妥布霉素1后，出现了明显的一个配体结合峰(m/z=2284.6077)和少量两个配体结合峰(m/z=2401.4221)，这与文献报道的该适体存在两个结合位点（一个高亲和力，一个低亲和力）的结果一致。

剂量反应实验显示，妥布霉素适体在1.25当量配体时接近饱和，2.5当量时完全饱和，5当量时可观察到第二个配体的结合。而卡那霉素B二聚体适体在0.16当量配体时结合很少，但随着配体浓度增加，结合逐渐增强，在>1.25当量时可观察到第二个配体结合，5当量时有少量第三个配体结合。

氨基糖苷类配体面板筛选结果显示，配体2（卡那霉素B）对两种适体的结合最强，妥布霉素适体结合率达90.1%，卡那霉素B适体结合率达55.4%。其他氨基糖苷类配体也显示出不同程度的结合，但均弱于同源配体，表明确实存在结合特异性和选择性。阴性对照配体d-葡萄糖胺7只有在过量添加(5-10当量)时才观察到少量结合。

3.2. 使用nMS进行化合物库筛选以结合RNA适体

研究人员构建了一个包含77种化合物的筛选库，这些化合物选自FDA批准的药物库，包括47种抗生素药物（涵盖7个已知以RNA结合为作用机制的药物类别：氨基糖苷类8-14、四环素类15-24、蒽环类25-31、大环内酯类32-43和林可酰胺类44-45、氟喹诺酮类46-51和恶唑烷酮类52-54），15种无RNA结合记录的药物55-69，以及15种分子量<300 Da的片段大小药物70-84。

筛选结果显示，所有氨基糖苷类化合物8-14都能与两种RNA适体结合，这与氨基糖苷类与RNA的普遍结合特性一致，但没有一个比同源配体1或2结合更强，表明适体的选择性在nMS分析中得以保持。

蒽环类药物是仅次于氨基糖苷类的第二大类RNA适体结合剂，与妥布霉素适体的结合强于与卡那霉素B适体的结合。米托蒽醌30和匹蒽醌25的结构密切相关，它们是妥布霉素适体的最强结合剂（结合率分别为52.8%和60.1%），与某些氨基糖苷类的结合强度相似，而30与卡那霉素B适体结合（19.7%），但25不结合。

三种大环内酯类药物（伊沙匹隆37、他克莫司40和雷帕霉素36）微弱结合（约2-9%结合）并选择性结合于妥布霉素适体。三种恶唑烷酮类药物中的一种，依哌唑胺52，与两种适体微弱结合。而一个片段化合物，氨苯砜73（一种无双 chiral center的双苯胺磺氧化物）对妥布霉素适体有微弱但选择性结合（约6%结合）。

五类药物化合物（氟米松57、艾司佐匹克隆59、依度沙班65、罗拉匹坦69和利拉利汀67）与两种适体结合，观察到与妥布霉素适体结合更强的趋势。四环素类、氟喹诺酮类和林可酰胺类化合物类别未观察到结合。

4. 结论

本研究证明了使用正负离子模式的nMS能够直接从水相样品中检测配体与RNA适体的结合，包括同源配体以及其他各种配体类别。使用质谱中结合峰和非结合峰的比例可以定量测量配体结合强度、特异性和选择性。nMS工作流程的其他优点包括它是靶点不可知的，不需要修饰RNA或配体（例如，不需要报告基团，如荧光标签或放射性核素），样品消耗低，并且有可能通过MS自动样品进样扩展到高通量筛选。

这项工作验证了通过其他生物物理方法确定的氨基糖苷类抗生素定量和定性结合的报告结果。nMS方法与RNA样品的一个关键挑战是非结构盐加合物的高水平，降低了检测配体结合的灵敏度，然而RNA配体结合的nMS峰与调整用于筛选的仪器参数的RNA加合物峰是不同的。使用具有亚微米直径开口的纳米电喷雾发射器可以改善高盐样品的nMS，在未来的研究中探索这种方法可能特别有意义，特别是允许更高浓度（mM范围）的Mg²⁺，通常用于RNA稳定性。

尽管RNA本质上是结构化的，但适体可以通过在配体周围适应性折叠获得明确构象，这涉及在结合过程中不同的构象有序过程，可能随着时间在配体存在下发生变化，然而nMS可以在单个质谱中观察所有样品物种，可能适合这一挑战。本研究中使用的RNA适体对氨基糖苷类结合有强烈偏好，但在九种不同的配体药物类别中显示结合，涵盖强、弱到无结合，以及与中性和带电配体的结合。