山柰酚通过双重靶向p53-p21-p16衰老通路与Nrf2/HO-1/NQO1抗氧化机制抑制动脉粥样硬化斑块形成：一项结合体内外研究的深入解析

　　本研究针对动脉粥样硬化（AS）治疗中残留心血管风险高、斑块不稳定性未解决的临床难题，系统探讨了天然黄酮类化合物山柰酚（KA）通过同时靶向Nrf2/HO-1/NQO1抗氧化通路和p53-p21-p16INK4a细胞衰老通路，在ApoE?/?小鼠模型和H2O2诱导的内皮细胞衰老模型中显著抑制斑块发展、增强斑块稳定性并改善血管微环境稳态的作用机制，为多靶点抗AS治疗提供了新策略。

　　

心血管疾病是全球首要死因，而动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是其主要的病理基础。尽管他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）方面取得显著成效，但仍有30%–40%患者面临残留心血管风险，斑块持续进展或不稳定。他汀类药物对晚期斑块的稳定能力有限，且长期使用可能加剧胰岛素抵抗和增加2型糖尿病发病率。这些局限凸显了仅靠降脂无法解决的残留风险和斑块不稳定性问题，迫切需要新的治疗策略。

近年来，大量证据表明，氧化应激和细胞衰老通过“氧化-炎症-衰老”的恶性循环加速斑块失稳。打破这一循环，同时纠正全身代谢失衡，成为干预AS的新方向。因此，具有多靶点调节特性的天然黄酮类化合物引起了广泛关注。山柰酚（Kaempferol, KA）是一种广泛存在于多种药用植物中的生物活性黄酮醇，在血管环境中发挥抗炎和抗氧化作用。此前研究发现，KA可通过阻断Piezo1通道和Ca²⁺内流抑制CD36介导的线粒体ROS产生，从而调节MAPK/NF-κB和Nrf2/HO-1通路抑制泡沫细胞形成；通过GPER介导激活PI3K/AKT/Nrf2通路缓解AS；促进M1向M2巨噬细胞复极化发挥抗炎作用；并通过调节OPN–CD44轴减轻炎症。然而，尽管取得了这些进展，尚未有研究探讨KA是否能对抗血管细胞衰老这一新兴且关键的斑块不稳定性驱动因素。

发表在《International Immunopharmacology》的这项研究首次全面证实了KA通过同时调节细胞衰老和氧化应激调控轴，在体内外模型中抑制AS进展。研究人员采用ApoE^?/?小鼠模型和高脂肪饮食（HFD）诱导AS，设置不同剂量KA干预组和阳性对照药物阿托伐他汀组，通过体内实验结合人类内皮细胞（EA.hy926细胞系）的体外实验，运用了包括组织染色（H&E、Masson、Oil Red O、Sirius Red）、免疫荧光双标、RNA测序、分子对接、Western blot、细胞活力检测（CCK-8）、SA-β-gal衰老染色、EdU增殖检测、细胞内ROS测定等关键技术方法。

3.1. KA改善AS模型的全身代谢和斑块稳定性

通过动态监测体重和血清脂质谱，研究发现HFD诱导的肥胖从第3周开始出现，模型组体重显著高于对照组。KA干预4周后，低剂量和高剂量组体重增加均显著减少。血清脂质分析显示，HFD喂养的ApoE^?/?小鼠出现严重血脂异常，TG、TC、LDL-C显著升高，HDL-C降低。KA给药产生剂量依赖性的脂蛋白改善，高剂量KA在所有参数上均优于阿托伐他汀阳性对照。

肝脏组织学检查显示模型组出现明显脂肪变性，肝细胞体积增大，脂质空泡增多，核位移增加。KA治疗以剂量依赖方式改善形态学指标，高剂量KA疗效超过阿托伐他汀。

主动脉窦Oil Red O染色显示，模型组脂质沉积增加41.0%，形成融合斑块和管腔狭窄。KA治疗以剂量依赖方式减少斑块脂质核心，高剂量KA与一线临床治疗相当。H&E染色进一步评估斑块稳定性，模型组内膜厚度增加337.8倍，泡沫细胞浸润占斑块面积的29.2%。KA治疗有减少泡沫细胞含量的趋势，但差异未达到统计学显著性。

Sirius Red染色显示模型组胶原明显减少，KA高剂量恢复胶原含量接近对照组水平，表明纤维帽增强。Masson三色染色量化微结构变化显示，与对照组相比，模型组纤维帽面积、坏死核心面积、帽/核比、帽厚度和弹性纤维断裂率均显著异常。KA干预显著改善这些指标，高剂量组实现纤维帽面积增加、坏死核心面积减少、帽/核比提高、帽厚度增加和弹性纤维完整性改善。

3.2. KA通过抗氧化应激和抗细胞衰老的双重机制抑制AS进展

分子对接预测KA与Nrf2蛋白高亲和力结合（结合能-7.7 kcal/mol），形成多个稳定接触，所有相互作用残基位于Nrf2的Neh2（KEAP1结合）和Neh1（DNA结合）结构域内，表明KA可能既抑制KEAP1介导的泛素化，又增强Nrf2对抗氧化反应元件（AREs）的识别。KA与p53蛋白对接（结合能-7.3 kcal/mol）显示独特的相互作用模式，KA通过氢键、π–π堆积和范德华力与Tyr327相互作用，稳定在DNA结合结构域内，与Asn288和Lys292的额外极性相互作用稳定了p53的DNA结合界面，而与Phe328和Ala353的疏水接触诱导α-螺旋区域轻微位移，可能阻碍p53与其同源DNA基序的结合。

主动脉组织RNA测序鉴定出4123个差异表达基因（DEGs），KA治疗逆转了其中一部分变化。交集分析确定325个重叠DEGs，这些基因富集于PPAR和PI3K-Akt信号通路，并与Nrf2依赖性抗氧化通路正相关。KA高剂量组显示Nrf2、HO1和GPX8表达显著上调。

Western blot分析证实KA剂量依赖性激活Nrf2通路。与对照组相比，HFD喂养的模型小鼠Nrf2、HO-1和NQO1水平降低。KA干预产生剂量依赖性改善，高剂量KA在Nrf2、HO-1和NQO1表达上超过阿托伐他汀。

主动脉根切片免疫荧光显示，KA通过促进Nrf2核积累恢复内皮完整性。对照组CD31染色显示连续内皮伴有核内强Nrf2信号。HFD喂养的模型小鼠显示CD31连续性破坏、Nrf2表达减少和内皮剥脱。KA低剂量部分恢复CD31连续性和Nrf2定位，而KA高剂量完全恢复内皮标志物分布并增强核Nrf2积累。

循环氧化应激标志物证实KA的系统性抗氧化作用。模型小鼠MDA显著增加，SOD活性下降。KA干预产生剂量依赖性改善，高剂量KA在SOD和MDA指标上优于阿托伐他汀。

3.3. KA通过抑制内皮细胞衰老减轻动脉粥样硬化斑块脆弱性

通过测量主动脉根切片中的γH2A.X（DNA损伤标志物）评估KA对血管内皮的抗衰老特性。与对照组相比，HFD喂养的ApoE^?/?小鼠γ-H2A.X荧光强度增加88.2%，表明斑块内DNA损伤诱导的衰老细胞积累。KA治疗显著减弱这一信号，荧光强度在KA低剂量组减少86.9%，高剂量组减少89.3%，超过阿托伐他汀的减少幅度。

p53（衰老标志物）和CD31（内皮标志物）共定位显示内皮完整性和衰老状态。对照组CD31阳性细胞形成连续单层，p53表达极少。HFD喂养小鼠显示CD31染色破坏，p53阳性增加。KA干预恢复内皮连续性并显著抑制p53表达至0.4%，优于阿托伐他汀。

Western blot分析显示HFD诱导衰老相关蛋白p53、p21、p16^INK4a显著上调，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）下调。KA治疗以剂量依赖方式逆转这些变化，高剂量KA显著降低p53、p21、p16^INK4a表达并增加eNOS表达，阿托伐他汀产生类似减少衰老标志物和eNOS恢复效果。

通过ELISA测量血清中促炎和基质重塑因子评估SASP调节。HFD喂养小鼠IL-6、IL-8、TNF-α、ICAM-1、CCL2和MMP-9显著增加。KA以剂量依赖方式显著抑制这些SASP组分，阿托伐他汀对大多数因子实现相当减少，但对MMP-9减少更有效，表明KA选择性调节SASP以改善血管微环境。

3.4. KA通过p53通路抑制内皮细胞衰老的机制验证

用300 μM H₂2O₂处理EA.hy926细胞诱导衰老，SA-β-gal阳性细胞增加4.18倍，EdU掺入减少50%，证实氧化应激介导的细胞周期停滞。通过CCK8 assay筛选，选择20和40 μM KA作为干预浓度。与KA共处理剂量依赖性地减少SA-β-gal阳性率64%和69%，恢复EdU掺入至对照水平的89%和104%，表明有效逆转衰老相关功能损伤。

Western blot分析证实这些发现：H₂O₂显著上调p53、p21和p16^INK4a，同时降低eNOS表达。KA在20 μM浓度下下调p53、p21和p16^INK4a，增加eNOS；在40 μM浓度下进一步抑制p53、p21和p16^INK4a并提升eNOS，证明KA通过调节关键细胞周期调节器和一氧化氮合成保持内皮功能。

暴露于300 μM H₂O₂显著增加EA.hy926细胞氧化损伤，细胞内ROS增加3.35倍，MDA增加61%，SOD活性降低46%，NO产生减少13%。KA在20 μM浓度减弱ROS积累77.7%，减少MDA 36%，增强SOD活性52%，增加NO 15%。在40 μM浓度，KA进一步抑制ROS和MDA，同时增强SOD和NO，证实剂量依赖性对抗氧化应激的保护作用。

与这些功能测定一致，Western blot证明H₂O₂抑制Nrf2抗氧化轴-Nrf2、NQO1和HO-1。KA在20 μM浓度上调Nrf2、NQO1和HO-1；在40 μM浓度进一步提升Nrf2、NQO1和HO-1，确认KA通过Nrf2通路激活增强内皮抗氧化防御。

为确认p53依赖性，内皮细胞与p53抑制剂Pifithrin-μ或激活剂Kevetrin与KA共处理。Pifithrin-μ模拟KA的抗衰老效果，减少SA-β-gal阳性率65%，恢复EdU掺入63%。相反，Kevetrin废除KA的保护作用，增加SA-β-gal阳性率230%，减少EdU掺入68%，证明KA逆转内皮衰老需要p53调节。

p53通路蛋白的Western blot分析进一步证实这些结果：Pifithrin-μ抑制p53、p21和p16^INK4a同时上调eNOS，与KA 40 μM效果平行。相反，Kevetrin逆转KA的调节-提升p53、p21和p16^INK4a，从而验证KA通过调节p53信号轴发挥其内皮抗衰老作用。

研究结论表明，KA通过同时调节细胞衰老和氧化应激调控轴，在AS进程中发挥保护作用。这种双向控制建立了分子“氧化还原-衰老稳态”，强调了在多因素疾病如AS中同时靶向氧化还原平衡和衰老的治疗潜力。有趣的是，KA的血管保护作用通过Nrf2和p53通路的独立和相互关联调节介导。分子对接和表达分析表明KA可以直接激活Nrf2，从而诱导HO-1/NQO1转录和恢复氧化还原稳态。同时，KA抑制p53-p21-p16衰老轴，缓解内皮细胞周期停滞和功能障碍。这种双重靶向可能具有功能协同作用：既往研究表明过度p53激活可以抑制Nrf2转录并负调节抗氧化活性。因此，KA抑制p53不仅防止内皮衰老，还可能通过缓解这种抑制性交叉对话间接维持Nrf2激活。这些作用共同在血管微环境中建立“氧化还原-衰老”平衡，这对稳定动脉粥样硬化斑块和改善内皮完整性可能至关重要。

讨论部分强调，这项研究提供了首个全面证明，天然黄酮类化合物KA通过同时在体内外模型中调节细胞衰老和氧化应激调控轴来阻止AS进展。研究发现深化了对黄酮类介导的心脏保护机制的理解，并引入了可能克服单药治疗局限的“多靶点协同”范式。AS发病机制由有害反馈循环驱动，其中ROS诱导内皮DNA损伤和细胞衰老，而SASP因子加剧炎症和氧化损伤。数据揭示KA通过双重机制破坏这一循环：激活Nrf2/HO-1/NQO1抗氧化通路，显著减少主动脉MDA和恢复SOD活性；抑制p53/p21/p16衰老级联，导致更少SA-β-gal阳性细胞和减轻SASP介导的炎症。

理论突破方面，传统AS治疗主要关注降脂，但许多患者在LDL最佳降低后仍显示斑块进展。组织病理学分析证明高剂量KA增加纤维帽/坏死核心比7.24倍并增强胶原沉积，这些变化与p53抑制和泡沫细胞含量减少强相关。这些观察重新定义了斑块稳定性不仅依赖于脂质核心减少，还取决于细胞衰老和细胞外基质重塑之间的动态相互作用。通过促进胶原合成和增强帽完整性，KA体现了斑块稳定化的新颖“基质代谢重编程”方法。

临床意义方面，虽然他汀类药物仍是AS管理的基石，但其益处主要是脂质中心的，对内皮衰老或氧化应激的直接调节有限。残留心血管风险仍然显著，长期使用与不良代谢效应相关。Senolytic药物选择性清除衰老细胞但不增强抗氧化防御或稳定细胞外基质，其在慢性心血管使用中的安全性仍不确定。药理Nrf2激活剂强力上调抗氧化反应但无法解决持续SASP驱动的炎症和组织重塑缺陷。相比之下，KA的机制在同一治疗框架内整合抗氧化和抗衰老通路。通过激活Nrf2/HO-1/NQO1同时抑制p53/p21/p16轴，KA中断ROS-DNA损伤-衰老反馈循环，促进一氧化氮生物利用度，并增强纤维帽稳定性。KA在模型中的疗效与高剂量阿托伐他汀相当，但KA还抑制了SASP，表明增加了抗衰老益处。这种双重作用方法提供了比单药治疗更广泛的心脏保护谱，同时靶向氧化损伤、血管老化和结构完整性。这种多靶点协同将KA定位为精准心血管治疗的有希望候选者，特别是在代谢综合征或尽管脂质控制最佳仍存在持续风险的患者中。

研究最后指出，局限性和未来方向包括KA在人类中的最佳剂量尚待确定，需要先进建模和安全评估。器官芯片平台已成为强大工具，可在体外重现人类斑块微环境和评估血管反应。同样，空间转录组学提供动脉粥样硬化病变内细胞类型特异性药物效应的高分辨率映射。全面药代动力学分析显示KA经历广泛的II相代谢，生物利用度中等，而人体药代动力学研究证实快速吸收和结合清除。此外，系统评价强调黄酮类补充剂调节代谢综合征参数和心血管风险的治疗潜力，且不良反应极小。这些方法将指导KA在心血管治疗中的剂量优化、安全评估和个性化应用。