基于MALDI MSI的5-氟尿嘧啶处理HepG2肿瘤球体空间脂质代谢异质性原位分析

　　本研究创新性地建立基于基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）的空间脂质组学方法，实现对5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的三维HepG2肿瘤球体不同区域（坏死区/静止区/增殖区）脂质分子空间分布的原位可视化分析，为肝癌化疗机制研究提供新视角。

　　

Highlight

三维肿瘤细胞球体（3D TCS）的空间脂质组学分析能够实现对单个球体内不同细胞区域代谢重编程的原位研究。然而，研究5-氟尿嘧啶（5-FU）对3D HepG2球体内源性脂质物种丰度和空间分布的改变仍存在挑战。本文系统优化了基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）方法，将空间脂质组学扩展到微区域水平，用于原位筛查和可视化5-FU处理的3D HepG2球体中的脂质变化。我们分别评估了羧甲基纤维素（CMC）、明胶和最佳切割温度（OCT）化合物包埋方案对10微米空间分辨率MALDI MSI分析的效果。结果表明，CMC包埋能完整保留3D空间结构，并基于空间脂质离子谱将球体划分为核心坏死区、中间静止区和外围增殖区。进一步通过空间筛查鉴定出坏死区、静止区和增殖区分别有35、40和30个与5-FU处理相关的差异脂质分子。主要失调的代谢通路是甘油磷脂代谢的生物合成，为5-FU抗肝癌（HCC）作用机制提供了可靠证据。此外，空间脂质组学结果显示5-FU处理的肿瘤球体中PA（磷脂酸）、PC（磷脂酰胆碱）、PG（磷脂酰甘油）、PI（磷脂酰肌醇）和SM（鞘磷脂）含量显著改变，并限制了中央坏死区的形成。这种MALDI MSI与3D HepG2球体的创新结合有助于我们更好地理解5-FU引发的脂质代谢与HCC异质结构之间的生物学过程。

Introduction

肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤，癌症相关死亡率排名第三。由于其内在的隐匿性，多数病例确诊时已处于晚期，错过了系统治疗的机会。其中肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌类型。虽然5-氟尿嘧啶（5-FU）作为典型化疗药物显著改变了晚期HCC的治疗现状，但由于肿瘤微环境（TME）中存在强耐药性，疗效仍然有限。因此阐明5-FU治疗HCC的分子机制至关重要。传统二维（2D）细胞培养模型在抗癌药物评估中存在局限性，无法模拟体内复杂的细胞-细胞和细胞-微环境相互作用。有趣的是，三维肿瘤细胞球体（3D TCS）越来越广泛应用于体外药物评估，能更真实地模拟肿瘤组织特征。当3D TCS直径超过500微米时，其内部结构通常分化为三个不同区域：外围增殖区、中间静止区和内部坏死区。这种空间组织密切模拟体内肿瘤结构的异质性细胞状态。近年来，转录组学、蛋白质组学和代谢组学已成为理解抗癌药物作用的重要工具。其中脂质作为关键代谢物类别，在肿瘤细胞增殖、凋亡、转移和药物反应等生物过程中起重要作用。目前3D TCS药物脂质组学分析主要采用流式细胞术、核磁共振（NMR）和液相色谱-质谱（LC-MS）技术，但这些方法无法保持生物样本结构完整性。基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）作为一种原位强大工具，能够实现无标记生物分子可视化。本研究首次建立高分辨率原位空间脂质组学MALDI MSI方法研究5-FU在3D HepG2球体中的效应。

Section snippets

Chemicals and reagents

2,5-二羟基苯甲酸（DHB）和氧化铟锡（ITO）载玻片购自Bruker Daltonics公司。三氟乙酸（TFA）来自Sigma-Aldrich公司。5-氟尿嘧啶（5-FU）购自阿拉丁公司。乙腈（ACN）来自Merck公司。杜尔贝科改良 Eagle培养基（DMEM）、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素、胎牛血清（FBS）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）均采购自标准供应商。

Construction and characterization of 3D HepG2 spheroid model

3D HepG2球体作为体外培养模型，因其能有效模拟肿瘤组织的空间结构和生理微环境而受到广泛关注。通过苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学表征发现，HepG2细胞形成的3D TCS内部区域显示明显的核固缩和核深染，表明在球体核心形成了坏死区域。

Conclusions

总之，我们基于H&E染色、细胞毒性评估和荧光显微图像，系统优化了MALDI MSI方法，将空间脂质组学扩展到微区域水平，实现5-FU处理的3D HepG2球体脂质变化的原位筛查和可视化。经过多种包埋方案优化后，CMC包埋的HepG2球体在10微米空间分辨率的MALDI MSI分析中保持了完整的3D空间结构。