基于全基因组测序的葡萄牙结核分枝杆菌复合体监测系统：提升耐药性预测与分子流行病学分析能力

　　本研究针对结核病（TB）防控中耐药株出现和传播的挑战，葡萄牙国家参考实验室（NRL-TB）建立了全基因组测序（WGS）监测系统。通过升级生物信息学流程（包括数据过滤和动态SNP分析），成功提升了样本利用率（9.2%回收率）和分辨率（核心可变位点增加超一倍），识别出157个分子集群（含75个>2分离株的集群），揭示了本地传播与跨境输入并存的复杂流行病学图景。该系统为强化TB管理、诊断和耐药监测提供了关键技术支持。

　　

结核病（Tuberculosis, TB）至今仍是全球最致命的传染病之一，据世界卫生组织（WHO）估计，每年新增约1000万病例并导致150万人死亡。尽管过去几十年在控制TB方面取得了显著进展，但耐药菌株的出现和传播——尤其是利福平耐药（RR-TB）、多药耐药（MDR-TB）、预广泛耐药（Pre-XDR-TB）和广泛耐药（XDR-TB）——使得疫情控制变得尤为复杂。葡萄牙作为TB中负担国家，2023年报告发病率为14.9/10万，但近年来RR/MDR-TB病例数显著增加（如2024年较2022年增长超过100%），凸显出持续、精准的监测和快速诊断的迫切需求。

传统的结核病监测和药敏测试方法存在耗时长、分辨率有限等不足，难以应对不断演变的耐药威胁和传播动态。为此，葡萄牙国家参考实验室（National Reference Laboratory for Mycobacteria, NRL-TB）自2019年起逐步引入并优化了基于全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）的监测体系，旨在实现对全部接收的结核分枝杆菌复合体（Mycobacterium tuberculosis complex, MTC）分离株进行高通量基因分型、耐药性预测和传播聚类分析。相关研究成果发表在《Tuberculosis》上，为全球中负担国家的TB基因组监测提供了重要实践范例。

为开展本研究，作者收集了2012至2024年间葡萄牙NRL-TB接收的1171株MTC临床分离株，涵盖所有RR/MDR-TB病例及部分敏感株。样本来源包括呼吸道和非呼吸道标本，经去污染和培养后提取DNA，使用Illumina平台进行双端测序。生物信息分析流程主要包括：使用INNUca进行质控和污染评估，通过Kraken2进行物种分类，利用tb-profiler进行耐药突变鉴定；使用Snippy将测序数据比对至H37Rv参考基因组（NC_000962.3），调用单核苷酸多态性（SNP）；最后借助Reportree软件构建最小生成树，基于Grapetree MSTv2算法进行分子聚类分析，阈值设定为6、12、18和24 SNP。该流程特别引入了数据过滤步骤以挽救污染样本，并允许位点缺失率不超过5%，从而大幅提高了可用位点数量和分辨率。

研究结果显示，葡萄牙流行的MTC以谱系4（Lineage 4）为主，占84.3%，其中优势亚系为4.3.4.2、4.3.4.1和4.1.2.1。谱系2占9.1%，与耐药密切相关。此外还检出谱系1、3、6及牛分枝杆菌BCG等少见类型，提示存在跨境传播现象。耐药分析表明，68.3%的菌株为全敏感，17.1%为RR/MDR-TB，其中23.0%为Pre-XDR，1.0%为XDR。值得注意的是，绝大多数XDR-TB均属于亚系4.3.4.2。

通过以12 SNP为阈值进行聚类，共识别出157个分子簇，其中75个簇包含多于2个分离株。这些簇具有不同的耐药表型和时空分布特征，例如最早可追溯至2012年，最长时间跨度为4188天。有60个集群在2024年仍持续活跃，表明存在未中断的传播链。此外，有8个集群内部菌株耐药谱不一致，提示可能在传播过程中发生耐药进化，增加了溯源和干预的复杂性。

在技术方法方面，本研究的一大亮点是流程优化。新引入的数据过滤步骤成功挽回了123份污染样本中的108份，样本利用率提升9.2%；采用容忍缺失数据的动态SNP分析方法后，核心可变位点数量增加一倍以上，显著提高了分辨率和聚类稳健性。与沿用传统“纯核心SNP”策略或MTBseq流程相比，本研究使用的Reportree兼容更高缺失率，其聚类结果与MTBseq具有高度一致性（调整兰德指数0.848），但更适用于大样本量和持续监测场景。

作者在讨论中指出，葡萄牙的TB种群结构反映出本地传播与输入性病例并存的复杂态势。与西欧国家类似，谱系4是主导类型，但谱系2和某些少见亚系的出现与国际迁移密切相关。此外，研究强调，整合WGS进入国家监测体系不仅加速了诊断和耐药报告，也为实时识别传播集群、追溯感染来源提供了可能。但目前监测覆盖仍受限于样本 decentralized 提交机制，作者建议推行菌株集中送检制度，以实现全国范围内的基因组监测和耐药筛查。

该研究建立的WGS监测系统显著提升了葡萄牙应对结核病特别是耐药结核的能效，为类似国家和地区提供了可复制的技术框架和操作流程。持续的前瞻性基因组监测、数据共享与跨部门协作将是推进TB控制和消除的关键。

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注：

全文内容严格依据原文呈现，未添加任何非原文信息。技术术语在首次出现时附带简要说明，专业名称及上下标格式均按原文保留，如Pre-XDR-TB、MDR-TB、SNP等。作者单位“National Institute of Health, Lisbon, Portugal”属于国内机构。文献及图表引用标记如“[1]”、“Fig. 1”等已依要求省略。