结核分枝杆菌临床分离株中基因内中尺度选择压力分析揭示阳性选择基因的稳健鉴定方法

　　本文推荐研究者采用GenomegaMap贝叶斯方法，在基因（Constant模型）、密码子（Independent模型）和局部区域（Window模型）三个尺度分析结核分枝杆菌(Mtb)临床分离株的正向选择。研究发现中尺度（密码子窗口）分析能最可靠地鉴定阳性选择基因（排除易受测序错误影响的PPE/PE_PGRS家族），并精确定位蛋白质中与耐药性（如药物靶点结构域）和免疫适应（ESX-1系统）相关的选择区域，为结核病(TB)耐药机制和病原体进化研究提供关键见解。

　　

Section snippets

INTRODUCTION

近期针对结核分枝杆菌(Mtb)临床分离株大规模基因组序列的研究报道了多个处于阳性选择状态的基因^1,2,3。传统上，阳性选择通过蛋白质编码区中非同义突变相对于同义突变的过量出现（即dN/dS比率）来指示，但文献中也采用SNP聚类（如非编码区）、同质化现象[4]和趋同进化的其他衡量指标[5]。这些方法揭示了Mtb在应对现代结核病(TB)临床治疗压力过程中的适应性进化。

Sources of Genomic Data

本研究分析了两组Mtb临床分离株：来自摩尔多瓦先前研究的2,057株分离株，以及CRyPTIC收藏的5,195株全球多样性分离株。摩尔多瓦分离株的原始测序数据（fastq文件）通过[12]提供的登录号从SRA下载。CRyPTIC收藏的测序数据集则基于[10]补充表3中的登录号获取。虽然无法根据谱系选择分离株（数据未明确标注），但两组数据集均覆盖了主要Mtb谱系，为全面分析选择信号提供了基础。

RESULTS

我们使用GenomegaMap中的三种模型来识别和比较两组Mtb临床分离株中处于阳性选择的基因。第一组是来自摩尔多瓦的2,236株Mtb临床分离株，代表了2018-2019年该地区所有报告病例[12]。原研究旨在识别该地区内的传播集群。这些分离株主要属于谱系2和谱系4，约一半分离株（通过基因型鉴定）对至少一种一线药物具有耐药性。第二组是来自CRyPTIC项目的5,195株全球多样性分离株，涵盖更多遗传背景和耐药谱。

通过比较三种模型（Constant/Independent/Window），我们发现中尺度（Window模型）分析能最可靠地鉴定阳性选择基因，排除易受测序错误影响的PPE和PE_PGRS基因。在摩尔多瓦和全球数据集中，分别鉴定出53和173个显著阳性选择基因，重叠率达36%。这些基因包括许多已知耐药基因（如katG、rpoB等），以及先前报道的 selection 基因（如resR、phoR）。此外，在多个ESX-1相关基因（如eccA₁、espA）中也观察到阳性选择信号，提示其可能参与免疫逃逸适应。

DISCUSSION

Mtb作为专性人类病原体已高度适应其生命周期，基因组相对同质（低多样性）[55]。全基因组范围内已发现强纯化选择证据[56]。然而，在单个分离株基因组中仍常观察到零星SNP和其他多态性（推测在感染过程中于患者体内产生[57]），这些低频（未固定等位基因，仅出现在一个或少数分离株中）变异反映了持续突变输入，其中部分可能受到阳性选择。

本研究通过多尺度选择分析，揭示了中尺度（密码子窗口）方法在平衡灵敏度和特异性方面的优势。Window模型能检测局部SNP簇中非同义突变的富集，避免全基因平均化（Constant模型）或过拟合（Independent模型）问题。在耐药基因中，该方法识别的选择区域与已知耐药相关蛋白结构特征高度一致（如RpoB的β亚基耐药决定区），验证了其准确性。ESX-1基因的选择信号则暗示了Mtb在应对宿主免疫压力过程中的适应性进化。

LIMITATIONS

GenomegaMap的局限性之一是在分析残基阳性选择时未考虑系统发育信息，因此对多次独立选择（同质化）的突变不敏感。这是为了效率考量，避免构建系统发育树（在数千个基因组规模下计算繁琐）。虽然大多数阳性选择区域呈现富含非同义突变的SNP簇，但同质化事件（如耐药突变独立发生）可能需要其他方法（如PHYLOPLAM）补充分析。

CONCLUSION

总之，GenomegaMap是评估阳性选择基因的有效工具，能良好扩展到大型基因组数据库分析。此外，我们的结果表明，与基因水平（Constant模型）和密码子水平（Independent模型）分析相比，中尺度（Window模型）评估能产生最可靠的阳性选择候选基因列表。Window模型利用局部区域SNP簇优势，提供更高统计功效和生物学解释性，为结核病耐药机制和病原体进化研究提供关键见解。