精氨琥珀酸裂解酶（argH）基因敲低对耻垢分枝杆菌体内外生长的抑制作用及其机制研究

　　本研究通过CRISPRi技术敲低耻垢分枝杆菌精氨琥珀酸裂解酶（argH）基因，证实其显著抑制细菌体内外生长，并揭示精氨酸补充可浓度依赖性恢复表型。体内金鱼感染模型显示argH敲低显著降低脏器细菌载量，且与杆菌肽/5-氟尿嘧啶存在协同效应。代谢组学分析表明argH通过破坏氨基酸稳态和需氧呼吸途径抑制增殖，为抗结核药物研发提供新靶点和策略。

　　

Highlight

菌株与培养基

耻垢分枝杆菌（Mycolicibacterium smegmatis）MC²155由复旦大学高明谦教授和王川教授惠赠。质粒pLJR962购自ATCC，单向导RNA（sgRNA）设计遵循用户手册及Jeremy M. Rock所述方法。所选sgRNA序列经耻垢分枝杆菌基因组比对以避免脱靶位点，随后构建敲低质粒并插入相应双链片段。

精氨琥珀酸裂解酶（argH）敲低显著抑制耻垢分枝杆菌体外生长

经盐酸四环素处理后，argH（LJ00_18725）在转录和蛋白水平的表达均显著下调，证实argH敲低菌株构建成功（图1）。以谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或硫酸铵作为唯一氮源时，argH敲低均显著抑制细菌生长，其中以谷氨酸为氮源时抑制效果最显著。在添加精氨酸的培养基中，生长抑制现象呈浓度依赖性缓解，表明精氨酸缺失是生长受限的主因。

讨论

既往研究显示argF缺失菌株在0.24 mmol/L精氨酸浓度下生长速率降低约10倍，而在0.96 mmol/L时仅出现短暂生长延迟。本研究虽观察到类似趋势，但低浓度精氨酸补充后的生长差异较既往报道更显著，可能源于菌株差异或培养条件不同。值得注意的是，精氨酸补充仅部分恢复敲低菌株生长，提示argH可能通过调控多重代谢通路影响细菌增殖。代谢组学数据表明精氨琥珀酸裂解酶缺失导致精氨琥珀酸积累，同时引发多种氨基酸水平紊乱，并显著降低琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）和乳酸含量，提示三羧酸循环（TCA cycle）和需氧呼吸过程受损。这些发现与结核分枝杆菌fumarase缺失导致致死性的报道相呼应，进一步支持精氨酸代谢通路作为抗结核药物靶点的潜力。

结论（Conclusion）

本研究成功建立耻垢分枝杆菌argH CRISPRi敲低模型，证实该基因缺失可通过破坏氨基酸稳态和能量代谢途径抑制细菌增殖。体内实验证明argH敲低显著减弱金鱼感染模型中的细菌存活能力。杆菌肽与5-氟尿嘧啶在联合argH靶向干预时表现出协同抗菌效应，为开发基于代谢靶点的抗结核联合疗法提供新思路。