单细胞RNA测序结合孟德尔随机化鉴定胃癌新型高危基因及体外验证

　　本研究针对胃癌靶向治疗疗效有限及现有标志物未能显著改善生存率的临床难题，整合scRNA-seq、eQTL和GWAS数据，通过双向孟德尔随机化(MR)分析鉴定出SORBS3、RMND5A、FBXO6、LPGAT1和EPHB4五个胃癌高危基因，并经体外实验验证其差异表达，为胃癌分子诊断和靶向治疗提供新方向。

　　

胃癌作为全球第五大常见恶性肿瘤，每年新增病例超百万，尤其在中国占全球发病率的50%。尽管诊疗技术不断进步，但晚期患者5年生存率仍低于20%，现有靶向治疗效果有限，迫切需要发现更特异性的分子标志物。传统研究多基于 bulk RNA-seq（批量RNA测序），无法解析肿瘤微环境中的细胞异质性，而孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)方法虽能揭示基因与疾病的因果关系，但尚未与单细胞技术充分结合。

为此，河北中医药大学李琪团队在《Global Medical Genetics》发表研究，创新性地整合单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)、表达数量性状位点(expression quantitative trait loci, eQTL)和全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)数据，通过双向孟德尔随机化分析鉴定胃癌高危基因，并经过体外实验验证，为胃癌精准诊疗提供新靶点。

研究主要采用四大技术方法：一是利用GEO数据库中GSE183904数据集（含29例胃癌组织+11例正常组织的158,500个细胞）进行scRNA-seq分析；二是基于eQTLGen Consortium的25,482例血液样本eQTL数据和BioBank Japan的167,122样本（含7,921胃癌病例）GWAS数据；三是采用R软件TwoSampleMR包进行逆方差加权(IVW)、MR-Egger等双向MR分析；四是通过RT-qPCR（实时定量聚合酶链反应）在GES-1正常胃上皮细胞和AGS/BGC-823/SGC-7901胃癌细胞系中验证基因表达。

^3.1. 胃癌细胞亚群注释

通过Seurat软件对158,500个细胞进行质控和聚类，识别出11种细胞亚型，包括自然杀伤细胞(KLRD1⁺)、T细胞(CD3D⁺)、上皮细胞(CDH1⁺)等。聚焦上皮细胞后发现，与正常组织相比，胃癌组织中DNA复制、细胞周期等通路激活，而胃酸分泌、蛋白消化吸收通路抑制，符合胃癌细胞增殖活跃和消化功能紊乱的特征。

^3.2. 上皮细胞内胃癌亚型鉴定

进一步将胃上皮细胞分为5种亚型：黏液 pit细胞(GKN1/GKN2⁺)、肠型细胞(REG4/TFF3⁺)、主细胞(LIPF/PGA3⁺)、肠内分泌细胞(CHGB⁺)和癌细胞(CEACAM5/CEACAM6⁺)。通过FindAllMarkers算法鉴定出2,463个细胞亚型标志物，KEGG富集显示癌细胞亚型中细胞周期、HIF-1等通路异常活跃。

^3.3. 孟德尔随机化确定基因与胃癌的因果关系

对15,695个eQTL基因进行MR分析，IVW算法筛选出149个与胃癌有因果关系的基因。进一步按log₂FC>1和效应方向一致过滤，最终锁定5个高危基因：SORBS3(OR=1.339)、RMND5A(OR=1.317)、FBXO6(OR=1.152)、LPGAT1(OR=1.141)和EPHB4(OR=1.055)，均显著增加胃癌风险。

^3.4. 高危标志物在胃上皮细胞中的分布

scRNA-seq数据显示5个基因在癌细胞亚型中特异性高表达，其中RMND5A、FBXO6、LPGAT1和EPHB4在肠型细胞（癌前病变特征细胞）中也有分布，提示它们可能参与胃癌早期演进。

^3.5. 高危标志物的体外验证

RT-qPCR实验证实：在3种胃癌细胞系中，SORBS3、FBXO6、LPGAT1和EPHB4均显著高表达（p<0.05）；RMND5A在SGC-7901中高表达，但在AGS和BGC-823中未达显著差异，可能与细胞异质性有关。

研究结论与讨论部分强调，SORBS3作为支架蛋白可能通过调控YAP1-WWTR1/TAZ信号通路影响自噬和ERK2激活；RMND5A参与泛素-蛋白酶体系统，与多种癌症迁移相关；FBXO6通过泛素化RIOK1促进胃癌进展；LPGAT1调控磷脂代谢和线粒体膜稳定性；EPHB4则已知与胃癌血管生成和转移相关。这五个基因此前在胃癌中均未受到充分关注，本研究通过多组学整合和实验验证，为其作为新型诊断标志物和治疗靶点提供了证据。局限性包括数据源自日本和欧洲人群，需更多种族验证，且需进一步开展蛋白水平机制研究和前瞻性队列评估。该研究为胃癌精准医疗开辟了新路径。