基于单细胞加权基因共表达网络与孟德尔随机化分析探索阿尔茨海默病浆细胞亚群及关键基因RGS1的临床验证

　　本刊推荐：本研究通过整合单细胞测序（scRNA-seq）、加权基因共表达网络分析（WGCNA）与孟德尔随机化（MR）方法，首次揭示浆细胞亚群在阿尔茨海默病（AD）中的关键作用，并鉴定出RGS1基因通过调控JAK-STAT、NF-κB和Wnt-β-catenin信号通路参与神经免疫调控。临床验证证实AD患者外周血单个核细胞（PBMC）中RGS1表达显著升高，为AD的免疫机制研究和靶向治疗提供新方向。

　　

背景

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种以记忆丧失为首发症状的神经退行性疾病，其主要病理特征包括大脑中β淀粉样蛋白（Aβ）斑块沉积和神经原纤维缠结（NFTs），最终导致神经元损伤和死亡。炎症反应在记忆障碍中扮演重要角色，活化的巨噬细胞和星形胶质细胞产生的炎症介质会导致炎症损伤和神经元死亡。近年来，AD治疗已从单一症状干预转向多靶点干预，但现有疗法无法逆转疾病，且干预时机较晚，缺乏有效的早期诊断和预防策略。因此，探索AD的病理机制以识别新的治疗靶点至关重要。

方法

生物信息学分析

研究从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库下载了GSE181279单细胞数据集和GSE153104表达谱数据，并使用Seurat包进行质量控制、标准化和和谐化整合。通过主成分分析（PCA）和t分布随机邻域嵌入（t-SNE）算法识别细胞亚群。高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）用于构建基因共表达网络，Metascape数据库进行功能注释。孟德尔随机化（MR）分析从eQTLGen Consortium和MR Base数据库获取数据，使用逆方差加权（IVW）等方法评估基因与AD的因果关系。免疫浸润分析采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法，基因集富集分析（GSEA）和基因集变异分析（GSVA）用于探索信号通路。

临床验证

研究纳入10例AD患者和10例健康对照，所有AD患者符合NIA-AA 2011诊断标准。通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测外周血单个核细胞（PBMC）中RGS1的表达水平，使用2^?ΔΔCt方法计算相对表达量。统计学分析采用R语言和GraphPad Prism软件，p值<0.05视为显著。

结果

细胞亚群注释

单细胞分析识别出21个细胞亚群，包括T细胞、B细胞、浆细胞、单核巨噬细胞等。浆细胞在AD患者中显著升高，并进一步鉴定出6个与AD相关的浆细胞亚型（C0、C2、C4、C5、C6、C7）。

hdWGCNA模块分析

hdWGCNA识别出4个基因模块（黄色、绿松石色、棕色和蓝色），其中棕色和蓝色模块与AD亚型显著相关。这些模块的基因主要富集于内在凋亡信号通路、mRNA代谢负调控、翻译调控和肽酶激活剂活性等过程。

孟德尔随机化分析

MR分析从200个候选基因中筛选出4个与AD风险相关的基因：MAL（OR=0.9995, p=0.0347）和RPS5（OR=0.9995, p=0.0230）为保护因素，COX4I1（OR=1.0009, p=0.0095）和RGS1（OR=1.0020, p=0.0123）为风险因素。验证集分析进一步确认RGS1与AD风险正相关（OR=1.2211, p=0.0187）。留一法敏感性分析显示结果稳健。

免疫浸润与功能富集

免疫浸润分析显示RGS1与巨噬细胞呈负相关，与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）呈正相关。GSEA和GSVA分析表明RGS1参与JAK-STAT、NF-κB和Wnt-β-catenin信号通路。转录因子调控网络分析发现RGS1受多个转录因子调控，其中cisbp__M1404 motif的标准化富集分数（NES）最高（4.74）。

细胞轨迹与表达模式

拟时序分析显示浆细胞在分化过程中基因表达动态变化，RGS1表达随细胞状态进展而上调。RGS1与焦亡相关基因（如NLRP3和PYCARD）显著相关，并与机械敏感离子通道PIEZO1强烈关联（r=0.785）。

临床验证

RT-qPCR结果显示AD患者PBMC中RGS1 mRNA表达水平显著高于对照组（p<0.01），与生物信息学分析一致。两组患者在年龄、性别、HAMA和HAMD评分上无显著差异，但AD组CDR评分较高（p<0.01）。

讨论

本研究通过多组学整合分析首次揭示浆细胞亚群在AD中的重要作用，并鉴定RGS1为关键风险基因。RGS1通过调控JAK-STAT、NF-κB和mTORC1信号通路参与神经炎症和免疫紊乱，其高表达可能与肠道菌群-脑轴和机械敏感通道PIEZO1相关。临床验证证实RGS1在AD患者外周血中表达升高，提示其作为潜在生物标志物的价值。局限性包括样本量较小和未直接验证脑组织表达，未来需进一步探索RGS1在微胶质细胞中的功能及其作为治疗靶点的潜力。

结论

RGS1是AD相关的关键基因，其通过多信号通路参与免疫调控和神经炎症过程。本研究为AD的免疫机制提供了新见解，并为开发早期诊断方法和靶向治疗策略奠定基础。

缩写

Aβ（β淀粉样蛋白）、AD（阿尔茨海默病）、CDR（临床痴呆评分）、eQTL（表达数量性状位点）、GEO（基因表达综合数据库）、GO（基因本体论）、GPCR（G蛋白偶联受体）、GSEA（基因集富集分析）、GSVA（基因集变异分析）、GWAS（全基因组关联研究）、HAMA（汉密尔顿焦虑量表）、HAMD（汉密尔顿抑郁量表）、hdWGCNA（高维加权基因共表达网络分析）、IVW（逆方差加权）、JAK（Janus激酶）、MR（孟德尔随机化）、MRI（磁共振成像）、NES（标准化富集分数）、NFT（神经原纤维缠结）、NIA-AA（国家老龄化研究所-阿尔茨海默病协会）、NK（自然杀伤细胞）、PBMC（外周血单个核细胞）、PCA（主成分分析）、RGS（G蛋白信号调控因子）、RT-qPCR（定量逆转录聚合酶链反应）、SNP（单核苷酸多态性）、ssGSEA（单样本基因集富集分析）、STAT（信号转导和转录激活因子）、t-SNE（t分布随机邻域嵌入）、WGCNA（加权基因共表达网络分析）。