没食子酸通过调控CXCL12/CXCR4-PI3K/AKT/mTOR轴增强卵巢癌顺铂化疗敏感性及生存获益的机制研究

　　本研究发现天然多酚化合物没食子酸（GA）能显著增强卵巢癌细胞对顺铂（DDP）的敏感性。通过调控CXCL12/CXCR4-PI3K/AKT/mTOR信号轴，GA在体外有效诱导癌细胞凋亡，在体内显著延长荷瘤小鼠生存期（中位生存期从30天延长至51天）且未见明显器官毒性，为铂类耐药卵巢癌患者提供了极具前景的辅助治疗策略。

　　

没食子酸选择性抑制卵巢癌细胞增殖并与顺铂产生协同效应

GA抑制卵巢癌细胞增殖

研究通过CCK-8实验证实，没食子酸（GA）对卵巢癌细胞A2780和ES-2的48小时半数抑制浓度（IC₅₀）分别为（10.89 ± 1.77）μM和（17.60 ± 1.12）μM，显著低于正常卵巢上皮细胞IOSE80的（168.10 ± 12.01）μM，表明GA对癌细胞具有选择性细胞毒性作用。HE染色显示，随着GA浓度增加，癌细胞密度逐渐降低，细胞失去正常结构，出现染色质浓缩、胞浆收缩等典型凋亡形态学特征。

GA与顺铂的协同效应

在ID8细胞系中，GA与顺铂（DDP）联用表现出显著协同效应。CompuSyn软件分析显示，所有浓度组合的联合指数（CI）值均小于1，表明联合治疗对细胞生长的抑制效果优于单一药物。根据剂量反应曲线，研究选择75 μM和150 μM GA与5 μM DDP的组合进行后续实验。

GA影响卵巢癌细胞生长

形态学观察进一步证实，GA处理导致A2780和ES-2细胞体积变小变圆，细胞核染色加深，出现细胞碎片，表明GA能有效抑制癌细胞生长并促进凋亡。

GA治疗卵巢癌的潜在靶点及转录组测序结果

通过网络药理学分析，GA与卵巢癌的共同靶点有115个，蛋白互作网络（PPI）识别出前15个核心靶点，包括ALB、ESR1、EGFR、SRC等。分子对接结果显示，GA与CXCL12和PARP1的结合能均小于-6.0 Kcal/mol，表明结合效果良好，提示GA与DDP的协同机制可能与靶向CXCL12和PARP1等关键蛋白有关。

转录组测序发现，GA处理后ID8细胞共有63个基因上调、308个基因下调。GO富集分析显示，生物过程主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶信号、转化生长因子-β受体信号、凋亡和细胞增殖等途径；细胞组分主要富集在细胞外基质、基底膜和质膜区域；分子功能主要富集在蛋白结合、信号受体结合和信号受体激活等方面。KEGG通路分析主要聚焦于PI3K-Akt信号通路、TGF-beta信号通路、ECM-受体相互作用等。这些结果表明GA可能通过影响PI3K-Akt和TGF-β等关键信号通路来抑制ID8卵巢癌细胞的增殖并促进其凋亡。

GA通过抑制CXCL12/CXCR4和PI3K/AKT/mTOR信号通路增强顺铂对卵巢癌细胞的凋亡诱导作用

Hoechst 33258染色显示，随着GA浓度增加，A2780和ES-2细胞的蓝色荧光强度增强，表明凋亡细胞数量增加。流式细胞术检测进一步证实，GA处理48小时后，A2780和ES-2细胞的凋亡率显著升高（均P<0.01），且呈浓度依赖性。在ID8细胞中，GA或DDP单独处理时凋亡率较低，但联合使用时凋亡率显著升高，分别达到47.02%和67.42%，表明GA与DDP联合能够产生显著的协同促凋亡效应。

Western blot分析发现，GA处理48小时后，A2780和ES-2细胞中PARP和Cleaved PARP蛋白表达水平增加（P<0.05）。在A2780细胞中，PI3K p110α、AKT、P-AKT、mTOR和P-mTOR的表达受到抑制，且这种趋势随GA浓度增加而增强。在ES-2细胞中，PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达未被抑制。在ID8细胞中，与对照组、单独GA组和单独DDP组相比，联合治疗组中CXCL12和CXCR4的表达显著抑制，下游PI3K、AKT、P-AKT和mTOR的表达也受到抑制，且随GA浓度增加而增强。磷酸化mTOR的表达没有显著变化。此外，联合治疗组中TGF-β1和β-catenin蛋白的表达也显著降低。

研究表明，GA能有效诱导卵巢癌细胞凋亡并与顺铂产生协同效应，其分子机制具有细胞类型特异性：在A2780和ID8细胞中通过抑制CXCL12/CXCR4和PI3K/AKT/mTOR通路信号实现，而在ES-2细胞中则通过不依赖该通路的其他方式发挥作用。

C57BL/6J小鼠移植瘤模型结果

GA单药及与顺铂联合治疗抑制小鼠肿瘤生长

从建模开始，每两天测量小鼠体重，监测生存状态，每三天进行一次活体成像观察腹腔肿瘤变化。结果显示，无论建模后是否进行GA预处理，肿瘤均在建模15天后出现。对照组小鼠的荧光值在肿瘤形成后持续升高，在第15天达到最大值，并伴有腹水和明显体重增加。治疗组荧光值达到最大值的时间延迟，DDP和联合治疗组小鼠在治疗后出现腹水症状的时间也延迟。

GA联合顺铂延长小鼠生存期

对数秩检验分析显示，对照组中位生存期为30天，A-GA 25 mg/kg组为38天，A-GA 50 mg/kg组为43天，A-GA 25 mg/kg + DDP 2 mg/kg组为45天，A-GA 50 mg/kg + DDP 2 mg/kg组为51天，GA 50 mg/kg组为36天，DDP 2 mg/kg组为42天，GA 50 mg/kg + DDP 2 mg/kg组为42天。除GA组外，其他各组的生存时间与对照组均有显著差异（P<0.05）。建模后立即使用GA治疗的小鼠比肿瘤形成后再使用GA治疗的小鼠生存时间更长。在保证安全剂量的前提下，药物剂量越高，生存时间越长。建模后使用50 mg/kg GA治疗的小鼠肿瘤形成时间没有延长，但肿瘤形成后使用2 mg/kg DDP联合治疗的小鼠带瘤生存时间比单独使用相同剂量DDP或相同剂量GA与DDP联合治疗的小鼠更长。这表明GA能够延长小鼠生存期，是一种起效和作用较慢的抗肿瘤活性成分，在体内发挥辅助治疗作用，有效增强DDP的效果。

HE染色结果显示GA对体内重要器官的安全性

对小鼠重要器官（心、肝、脾、肺、肾和脑）进行HE染色观察组织病理学变化。结果显示，与对照组相比，治疗组小鼠的重要器官未见明显异常。此前研究发现，GA小鼠腹腔注射的半数致死量（LD₅₀）为4.3 g/kg，顺铂为27 mg/kg。这证明本实验使用的GA剂量对体内重要器官的毒理学影响极小。

IHC验证GA联合顺铂在体内抑制Ki67表达和促进cleaved-PARP表达

免疫组化染色检测Ki67和Cleaved-PARP在C57BL/6J小鼠卵巢癌移植瘤组织中的表达。结果显示，GA治疗后，ID8细胞移植瘤组织中Ki67表达降低，GA与DDP联合治疗组Ki67表达显著低于单独GA和单独DDP组，差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比，治疗组ID8细胞移植瘤组织中Cleaved-PARP表达增加，表明GA能有效抑制卵巢癌体内增殖，且与DDP联用可产生协同效应。

讨论

卵巢癌仍然是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的疾病，主要原因是其快速获得铂类耐药性。从天然植物中提取的活性单体和次生代谢物是开发新药的重要来源，在恶性肿瘤治疗中具有独特优势。虽然此前有研究报道GA能抑制卵巢癌细胞增殖，但大多局限于体外细胞毒性或单一通路描述。本研究首次综合证明GA通过重塑CXCL12/CXCR4-PI3K/AKT/mTOR轴显著提高铂耐药卵巢癌对顺铂的敏感性，并将这一机制转化为免疫活性原位模型中的生存期延长。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是与肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、转移以及放化疗耐药密切相关的关键细胞内信号通路。药用植物活性单体可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路显著增强化疗药物的抗癌效果。GSK3（糖原合成酶激酶3）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞骨架蛋白β-catenin的降解和凋亡过程中起重要作用。GA抑制AKT，从而逆转GSK3的失活，促进β-catenin降解，进而增强顺铂对卵巢癌细胞的凋亡诱导作用。

CXCL12（CXC趋化因子配体12）属于CXC趋化因子家族，在细胞归巢和肿瘤转移中扮演多重角色。CXCR4（CXC趋化因子受体4）是CXCL12的特异性受体。CXCL12/CXCR4轴参与多种病理生理过程，包括细胞间通讯、免疫反应介导、血管生成以及肿瘤侵袭和转移。显然，PI3K/AKT/mTOR信号通路是CXCL12/CXCR4轴的下游通路之一，在肿瘤转移和血管生成中起重要作用。

AKT过度磷酸化现被认为是卵巢癌铂外排、增强DNA损伤修复和抗凋亡信号的核心驱动因素。本研究发现GA不直接结合PI3K催化亚基，而是下调CXCL12转录，从而破坏通常维持PI3K膜募集和AKT Ser473磷酸化的CXCL12/CXCR4自分泌环。这种作用模式与乳腺癌中发现CXCR4阻断恢复对PI3K抑制剂敏感性的结果一致，但从未在卵巢癌中研究过，也从未与GA关联。

多组学整合分析突显GA作为表观遗传-免疫-代谢调节剂的作用。通过网络药理学、分子对接和转录组测序，转录组分析发现308个下调基因富集于PI3K-Akt和TGF-β通路。通路相互作用分析确定CXCL12为主要调节因子，其抑制同时抑制了MTOR驱动的糖酵解（HK2、LDHA下调）和TGF-β介导的上皮间质转化（SNAI1、VIM抑制）。这种多效性与2024年高级别浆液性卵巢癌单细胞图谱的发现一致，该图谱将CXCL12高表达肿瘤细胞识别为铂耐药糖酵解亚群。

值得注意的是，本研究中西罗莫司（mTOR）的磷酸化水平并未被GA有效降低，提示PI3K/Akt/mTOR通路内部存在补偿机制以维持其磷酸化状态。当Akt被强烈抑制时，上游信号（如受体酪氨酸激酶RTKs）或平行通路（如MAPK通路）的负反馈抑制可能被解除，导致补偿性信号激活以维持mTOR磷酸化。这意味着尽管总mTOR池减少，但剩余mTOR分子被这种补偿信号"过度激活"的比例可能增加，维持了p-mTOR的水平。最关键的结论应基于下游效应分子（S6K、4E-BP1）的磷酸化状态。

体内实验发现GA起效缓慢，与DDP联用需要较长时间才能显示联合效应。长期使用GA可促进DDP的凋亡效应，显著延长小鼠生存期。GA广泛存在于山茱萸、漆树、栎树皮和茶叶等植物中，提取工艺成熟，生产成本低，且体内毒性极低。因此，GA可作为术后辅助治疗或辅助饮食疗法临床使用。术后长期使用GA可能有助于延长患者的无复发生存期和总生存期。

药用植物活性单体没食子酸表现出显著抗卵巢癌活性，具有多靶点、多通路特征。它能增强铂类药物疗效，与铂类药物联用是一种有前景的抗癌方案。GA在饮食来源中含量丰富，安全性明确（小鼠LD₅₀为4.3 g/kg）。在50 mg/kg剂量下（仅为LD₅₀的1/86），GA实现了强劲疗效且无体重减轻或器官毒性。在患者中，等效血浆浓度（约5 μM游离GA）可通过1-1.5 g口服补充达到，提示在细胞减灭术后辅助维持治疗中具有可行性。

实验部分

一般实验程序

卵巢癌A2780和ES-2细胞购自国家生物医学实验细胞资源库。ID8细胞由北京大学人民医院妇产科捐赠。正常卵巢IOSE80细胞由广西医科大学生命科学研究院医学实验中心提供。

细胞培养

A2780细胞用RPMI1640培养基培养，ES-2细胞用McCoy’s 5A培养基培养，ID8和IOSE80细胞用高糖DMEM培养基培养。完全培养基通过添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液和1% L-谷氨酰胺制备。细胞在37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养，每2-3天更换培养基。当细胞密度达到约90%时，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，按1:3比例传代。实验使用处于指数生长期且状态良好的细胞。

没食子酸纯度测定

采用高效液相色谱法测定GA纯度，结果显示样品纯度为98.34%。

CCK-8法评估GA细胞毒性作用及与顺铂协同效应

将细胞接种于96孔板，24小时后更换含不同浓度GA的培养基，继续培养48小时后加入CCK-8试剂，测定450 nm吸光度值，计算细胞抑制率和IC₅₀值。使用CompuSyn软件分析联合指数（CI）。

HE染色观察细胞形态

将细胞接种于放置盖玻片的6孔板中，24小时后更换含不同浓度GA的培养基，继续培养48小时后进行HE染色，显微镜下观察细胞形态变化。

网络药理学和分子对接预测GA治疗卵巢癌靶点

使用PubChem、Swiss Target Prediction和SEA数据库预测GA靶点，从GeneCards数据库检索卵巢癌相关靶点，获取交集靶点后导入STRING数据库构建PPI网络，使用Cytoscape软件和Cyto Hubba插件识别核心靶点，最后进行分子对接分析。

转录组测序

提取经不同浓度GA处理48小时的ID8细胞总RNA，送北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。

差异基因表达分析及GO、KEGG通路富集分析

使用DESeq2算法进行差异基因表达分析，以|log2(Fold Change)|≥1且Padj ≤ 0.05为标准筛选差异表达基因（DEGs），然后进行GO和KEGG功能富集分析。

Hoechst 33258染色检测细胞凋亡

将细胞接种于放置盖玻片的6孔板中，经GA处理48小时后固定，Hoechst 33258染色，荧光显微镜下观察凋亡情况。

Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡

将细胞接种于6孔板，经不同处理48小时后收集细胞，Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞仪检测凋亡率。

Western blot分析相关蛋白表达

提取经不同处理后的细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，电泳、转膜后与相应一抗、二抗孵育，显色后使用ImageJ软件分析相对表达水平。

C57BL/6J小鼠卵巢癌移植瘤模型

动物分组与建模

健康雌性C57BL/6J小鼠适应一周后，腹腔注射5×10⁷个/mL的Luc-ID8细胞悬液0.1 mL。随机选取9只小鼠从第二天开始每隔一天腹腔注射50 mg/kg GA，其余小鼠建模两周后通过活体成像观察腹腔肿瘤形成情况，随机分为对照组、GA组、DDP组和联合治疗组，从肿瘤形成后第一次治疗开始每隔一天治疗一次，测量体重，每隔一天成像一次监测肿瘤大小。

HE染色评估GA对体内重要器官安全性

取小鼠重要器官固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察组织病理学变化。

免疫组化染色检测Ki67和cleaved-PARP蛋白表达水平

石蜡切片脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶活性、封闭后与一抗、二抗孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水透明后甘油明胶封片，显微镜下观察，ImageJ软件分析。

统计分析

使用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，定量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。