城市农业系统中叶菜与土壤相关细菌的多重耐药性：基因组视角下的抗性机制与传播风险

　　本研究通过全基因组测序深入解析了城市农场与社区菜园中叶菜及土壤来源的多重耐药（MDR）菌株的耐药基因（ARGs）、移动遗传元件（MGEs）和应激响应机制，揭示了以假单胞菌属（Pseudomonas）和沙雷氏菌属（Serratia）为主的土壤源性耐药菌在新鲜农产品中的广泛存在及其潜在传播风险，为城市农业食品安全与公共卫生策略提供重要依据。

　　

引言

随着全球人口快速增长，粮食与营养安全问题日益突出。城市农场和社区菜园在强化本地食物生产、促进社区参与和增加城市绿地方面具有重要作用。然而，城市土壤受高密度人类活动产生的污染物（如重金属、农药）影响，可能导致土壤肥力下降并富集生物性污染物，包括人类病原菌和抗菌素耐药性（AMR）细菌。AMR在美国每年导致约280万感染和超过3.5万人死亡，农业系统被广泛认为是AMR传播和多重耐药（MDR）菌出现的重要推手。畜禽养殖中抗生素使用可能导致动物粪便中残留抗菌药物和AMR基因（ARGs），这些基因甚至在堆肥等处理后仍可存留。此外，作物生产环境中常见的农药和重金属等污染物也可能施加选择性压力，促进AMR细菌的选择与增殖。

新鲜农产品是AMR和MDR微生物的一个新兴但尚未被充分研究的储存库。果蔬天然携带复杂微生物群落，细菌载量可达每克10³–10⁸，部分菌株携带固有或获得性ARGs。在恶劣环境条件（如化学物质暴露、营养限制、温度波动）下，ARGs可能与应激响应基因（如涉及毒力、杀菌剂抗性和重金属抗性的基因）发生共选择。这些适应性过程由移动遗传元件（MGEs）介导的基因转移所驱动，其在包括叶菜、胡萝卜、番茄和香草在内的多种新鲜农产品中均有报道。

尽管有机土壤改良剂对恢复城市农业土壤健康至关重要，但其对AMR细菌的影响并不一致。近期研究表明，与原生土壤相比，城市农场中的有机投入可降低土壤中氨苄青霉素和四环素抗性菌的比例，可能反映了微生物群落变化对AMR菌群的缓解或稀释作用。然而，我们也观察到从叶菜和土壤中分离的AMR菌株中MDR发生率较高，表明存在广谱抗性机制和/或ARGs的共选择。

方法

采样与MDR细菌分离

本研究基于对华盛顿特区及周边城市与城郊农场（5个点位）和社区菜园（2个点位）的微生物学田间调查。采集叶菜蔬菜（包括羽衣甘蓝、卷心菜、生菜和甜菜品种）及其生长地块或高床的样本，使用无菌技术收集叶组织（LT）和根区土壤（RZS），同时采集代表各点位“原生”或未改良土壤的批量土壤（BS）样本。通过添加氨苄青霉素（32 μg ml^-1）或四环素（16 μg ml^-1）的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）培养基，在37°C培养24小时后，对样品中的氨苄青霉素（Amp）或四环素（Tet）抗性细菌进行计数和分离。通过复制平板 assay 筛选对三种或以上抗生素类别（包括Amp、Tet、阿奇霉素[Azi]、环丙沙星[Cip]、氯霉素[Chl]、头孢噻肟[Cef]和庆大霉素[Gen]）具有抗性的MDR菌株。

测序与生物信息学分析

对MDR分离株进行全基因组测序（WGS），使用Illumina NextSeq1000平台进行双端测序（2x150循环），目标覆盖度为75倍。对测序读数进行预处理和组装，通过CheckM评估基因组质量，选择完整度>95%、污染度<5%的高质量基因组进行下游分析。利用GTDB-Tk对基因组进行物种水平分类，通过dRep鉴定冗余并基于0.95的ANI阈值确定独特物种数量。使用AMRFinderPlus和CARD-RGI工具查询AMR和毒力相关基因，通过mobileOG数据库和Diamond进一步分类与MGEs相关的基因。

统计分析

使用R语言进行数据可视化，应用ANOVA比较不同样本类型（LT、RZS、BS）的分离株基因组大小，使用卡方检验比较不同属的MDR分离株数量、AMR表型和基因型。

结果

MDR分离株的分类学特征

研究获得87个MDR分离株的高质量基因组组装，其中29个来自20个叶组织样本，42个来自32个根区土壤样本，16个来自12个批量土壤样本。根区土壤（5,690 ± 1,092 kbp）和批量土壤（5,554 ± 788 kbp）分离株的基因组大小显著大于叶组织（4,931 ± 530 kbp）。大多数MDR分离株属于假单胞菌门（Pseudomonadota）（73株，84%），包括假单胞菌属（Pseudomonas）（29株）、沙雷氏菌属（Serratia）（22株）和普罗维登斯菌属（Providencia）（11株）。其次是芽孢杆菌门（Bacillota）（12株，14%），主要为芽孢杆菌属（Bacillus）（11株）。普罗维登斯菌属与叶菜显著相关，而芽孢杆菌仅从土壤中分离。还发现了放线菌门（Actinomycetota）和拟杆菌门（Bacteroidota）的菌株，包括未分类链霉菌（Streptomyces）和金黄杆菌属（Chryseobacterium）的新物种。共鉴定出44个独特物种，优势种包括解脲沙雷氏菌（Serratia ureilytica）（10株）、Pseudomonas fulva（6株）和Pseudomonas manganoxydans（5株）。这些MDR菌株主要反映土壤相关类群，未发现已知食源性病原菌。

分离株的AMR表型和基因型

所有测序分离株均对Amp耐药（100%），多数对Tet耐药（60.9%），高比例对Cef（77%）、Azi（77%）、Chl（59.8%）、Cip（39.1%）和Gen（14.9%）耐药。叶菜来源分离株对Azi和Chl的耐药率更高，而土壤来源分离株对Gen的耐药率更高。使用AMRFinderPlus和CARD分别鉴定出46和158个独特ARGs。假单胞菌属编码多种外排泵（如mexE、emhC）、重金属耐受（如cueA、copA）和杀菌剂抗性（如ttgA、ttgB）基因。沙雷氏菌属均对Amp、Azi和Tet耐药，携带外排（如smfY、sdeB）、四环素外排（tet(41)）以及β-内酰胺酶（blaSRT、blaSRT-3）和氨基糖苷类修饰酶（aac(6)-lal、aac(6)）基因。普罗维登斯菌属平均对5种抗生素耐药，但AMRFinderPlus未鉴定出ARGs，而CARD识别出多种外排（如adeF、qacG）及万古霉素（van簇）、四环素（tet(59)）和磷霉素（FosA8）抗性基因。芽孢杆菌属均对Amp耐药，多数对Cef和Tet耐药，携带β-内酰胺酶（bla2、bla）、链丝菌素（satA）和磷霉素（fosB）基因。CARD还识别出tet(45)和tetB(P)可能贡献四环素抗性。多种ARGs在特定样本类型中显著富集，如blaSRT-3在叶菜中更常见，而bla、bla2、blaL1和smeF仅在土壤中发现。

ARGs相关的移动遗传元件

利用mobileOG鉴定出质粒、接合元件（CE）、插入序列（IS）、噬菌体和交互元件（IGE）等MGEs，其中质粒是最丰富的MGE类别，存在于所有MDR分离株基因组中。19个AMRFinderPlus鉴定的ARGs位于MGEs的5,000 bp范围内，包括与外排泵smfY（与质粒相关，41次）、重金属耐受基因fieF（与“质粒、CE”相关，21次）、氨基糖苷类抗性基因aac(6)和aac(6)-lal（与噬菌体和质粒相关，各14次）以及四环素基因（tet(L)、tet(B)、tet(45)）（主要与质粒相关）。

讨论

城市农业因其对社区和可持续性的积极影响而日益普及，但城市景观的异质性导致土壤和作物微生物组动态变化。在可变亚致死环境压力下，AMR细菌可能被选择，ARGs通过水平基因转移传播。尽管AMR和MDR日益被认为是食品安全的新兴风险，但其在城市农业中的具体影响尚不明确。本研究旨在了解城市农业采收前环境（从城市土壤到叶菜产品）中MDR细菌的类型以及ARGs和MGEs的多样性。

MDR分离株包括44个物种，主要为假单胞菌门（如假单胞菌属、沙雷氏菌属、普罗维登斯菌属）和芽孢杆菌门（如芽孢杆菌属）成员。尽管未发现食源性病原菌，但部分菌种具有临床意义，如与MDR医院感染相关的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）以及与儿科患者相关的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）。因此，了解土壤源性病原体通过食物进入医疗环境的环境传播对公共卫生具有重要意义。

为表征AMR基因型，我们采用AMRFinderPlus和CARD进行互补分析。AMRFinderPlus更严格地筛选与抗性相关的基因变异，但偏向于模式和致病生物；CARD数据库更全面，但预测敏感性较低。ARGs在物种和属水平上高度保守，但某些分类群（如沙雷氏菌属、普罗维登斯菌属、芽孢杆菌属）内仍存在表型变异，表明未注释为AMR基因的替代调控元件或附加基因可能发挥作用。

ARGs在土壤和植物微环境的高度竞争生态位中对细菌生存至关重要。外排泵是本研究中最丰富的ARG类别，对土壤中的化学应激调节至关重要。我们还发现了多种杀菌剂和金属耐受基因，如fieF，其在许多基因组中与质粒和CE序列相关。金属耐受基因在宏基因组研究中常与ARGs和MGEs共同转移。通过水平传输的基因共享进一步驱动了采收前复杂生态系统中的ARG多样性。由于土壤是抗生素和ARGs的储存库，已知病原生物常通过MGEs从环境生物获得ARGs。我们的研究揭示了某些MGE（主要是质粒）的关键基因关联，进一步研究其向机会性或致病性细菌动员和转移的潜力对保障食品安全具有应用价值。

结论

本研究提出了一个从城市农场和社区菜园的土壤和采收前叶菜中回收的MDR细菌新集合。通过综合生物信息学方法，我们识别了这些环境中可能贡献MDR的分类群和基因型。尽管分离株未被鉴定为食源性病原菌，但部分携带的ARGs与MGE序列（主要是质粒元件）邻近。需通过长读长测序和机制研究进一步验证质粒携带ARGs在表型赋予中的作用，以理解ARG动员的潜力。尽管我们的发现提供了可培养MDR细菌的快照，但更广泛的分子方法（如宏基因组学）将为城市食物系统相关的微生物组和抗性组提供更深入的见解。随着城市农业在全球持续扩张，进一步调查这些独特环境相关的微生物群对于制定确保食品安全的策略至关重要。