基于网络药理学、分子对接与孟德尔随机化的知母治疗骨质疏松症作用机制研究

　　本研究通过整合网络药理学、分子对接与孟德尔随机化方法，系统揭示了知母（Anemarrhena asphodeloides）治疗骨质疏松症（OP）的多靶点作用机制。研究发现知母活性成分通过调控AKR1C1、AKR1C2、ABCC1、SMO、AKT1等关键靶点，影响PI3K-Akt、VEGF等信号通路，为中药治疗骨质疏松提供了新的理论依据和实验证据。

　　

1. 引言

骨质疏松症（OP）是最常见的人类骨骼疾病，以骨密度降低、骨微结构异常和骨脆性增加为特征。中医将OP归类为"骨痿""骨痹"，认为"肾主骨"理论与之密切相关。知母作为传统中药，归肺、胃、肾经，具有清热泻火、滋阴润燥功效。现代研究表明知母含有黄酮类、甾体皂苷、多糖等多种活性成分，具有抗炎、抗骨质疏松和抗氧化等生物活性。

2. 材料与方法

研究采用SPF级雌性SD大鼠建立骨质疏松模型，通过卵巢切除术造模。知母切片购自湖北天济药业有限公司。通过网络药理学方法从TCMSP数据库获取知母活性成分（OB>30%，DL>0.18），从GeneCards和OMIM数据库获取OP相关基因。使用STRING平台进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，通过Cytoscape筛选核心靶点（度值>5）。采用孟德尔随机化方法整合OpenGWAS数据库的GWAS数据，使用AutoDock Vina进行分子对接验证。Western blot检测股骨组织中关键靶点蛋白表达。

3. 结果

3.1. 知母与OP的交叉靶基因

从知母25种成分中筛选出398个潜在靶点，与6435个OP相关靶点取交集获得253个重叠靶基因。构建的复合靶点网络包含280个节点和1663条边。

3.2. PPI网络构建

通过STRING平台分析获得PPI网络，筛选度中心性>5的核心靶点构建网络图。

3.3. GO和KEGG富集分析

GO分析显示生物过程主要涉及ERBB2信号通路（GO:0038128）、肽酪氨酸自磷酸化（GO:0038083）和磷脂酰肌醇3-激酶信号（GO:0014065）。分子功能主要体现在胰岛素受体底物结合（GO:0043560）、蛋白酪氨酸激酶活性（GO:0004713）和ATP结合（GO:0005524）。细胞组分主要定位在质膜（GO:0005886）和细胞质（GO:0005737）。KEGG通路分析表明知母可能调控PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路和VEGF信号通路。

3.4. 孟德尔随机化分析结果

孟德尔随机化分析获得5个显著基因（p<0.05）。AKR1C1、AKR1C2和ABCC1对OP的因果效应估计呈现一致趋势，为危险因素；SMO和AKT1的因果效应估计趋势相反，为保护因素。

3.5. 敏感性分析

MR-Egger回归分析显示所有基因的截距p值均>0.05，表明SNP与结果间不存在水平多效性。Cochran's Q检验显示Q_pval>0.05，确认所选SNP不存在异质性。

3.6. 分子对接结果

分子对接结果显示所有对接的结合能均低于-5.0kcal/mol，表明知母活性成分与治疗OP的靶点之间存在强结合亲和力。关键活性成分包括知母皂苷A-I、知母皂苷A-III、萨洒皂苷元、马克皂苷元等。

3.7. Western blot分析结果

Western blot结果显示，知母治疗显著下调AKR1C1、AKR1C2和ABCC1的表达（与模型组相比，p<0.01），上调AKT1和SMO的表达（与模型组相比，p<0.01）。

4. 讨论

4.1. AKT1的作用机制

AKT1在PI3K-Akt信号通路中起关键调控作用。知母中的有效成分山奈酚可能通过氢键、π-烷基相互作用等与AKT1紧密结合，通过激活PI3K-Akt通路促进AKT1的磷酸化表达，从而实现治疗OP的效果。

4.2. AKR1C1和AKR1C2的作用机制

AKR1C1和AKR1C2属于醛酮还原酶家族，参与类固醇激素代谢等生理过程。AKR1C2可通过将高活性的二氢睾酮还原为低活性的3α-二醇来降低雄激素水平，而雄激素水平降低是OP的重要诱因。AKR1C1可通过靶向孕酮受体作为成骨分化的负调控因子。

4.3. SMO的作用机制

SMO在Hedgehog信号通路中起关键作用，该通路在骨骼发育和骨代谢中具有重要功能。研究表明Hedgehog信号通路协调软骨内成骨并平衡成骨细胞和破骨细胞活化以维持脊椎动物的稳态。知母中的薯蓣皂苷可促进Hedgehog信号通路激活，从而增强大鼠骨髓干细胞的成骨分化。

4.4. ABCC1的作用机制

ABCC1是位于细胞膜上的转运蛋白，属于ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族。当表皮生长因子受体（EGFR）信号激活时，会触发破骨细胞分化，进而导致OP，在此过程中ABCC1的表达水平呈现显著上升趋势。

5. 结论

知母中的多种活性成分与AKR1C1、AKR1C2、ABCC1、SMO和AKT1编码的蛋白质密切相关。知母活性成分可能通过抑制体内AKR1C1、AKR1C2和ABCC1基因的表达，同时促进AKT1和SMO的表达来抑制OP的发生。