促动力素-2（PK2）作为克服多细胞乳腺癌球体阿霉素耐药性潜在药效学生物标志物的鉴定

　　本研究通过构建人源3D乳腺癌球体（HBCSs）模型，首次揭示促动力素-2（PK2）可作为预测阿霉素（Dox）疗效的药效学标志物。研究发现高浓度Dox通过诱导活性氧（ROS）积累和caspase-3（Cas3）介导的线粒体/核凋亡克服缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）相关耐药机制，且PK2释放水平与Dox疗效呈正相关，为乳腺癌耐药治疗提供了新型生物标志物和策略方向。

　　

引言

乳腺癌作为全球第二大死亡原因，其治疗仍面临化疗耐药重大挑战。阿霉素（Dox）虽为一线化疗药物，但耐药性导致治疗失败率高达20-30%。本研究通过构建模拟肿瘤微环境的三维（3D）多细胞乳腺癌球体（HBCSs），探究Dox耐药机制并寻找可预测疗效的生物标志物。

实验方法

研究采用人乳腺癌MDAMB231细胞、人脐静脉内皮细胞（ECs）和人肺成纤维细胞（FBs）以1:2:2比例构建HBCSs模型，并给予1-400 μM梯度浓度Dox处理72小时。通过CellTiter-Glo 3D检测细胞活力，RT-PCR分析基因表达，免疫荧光检测HIF-1α和活性caspase-3（Cas3）蛋白，TUNEL法检测细胞凋亡，荧光探针DHR-123检测活性氧（ROS）水平，ELISA检测培养上清中促动力素-2（PK2）浓度。

关键结果

3.1 Dox在3D乳腺癌球体中的疗效评估

低浓度Dox（3 μM）即可使球体活力下降60%，但10-100 μM浓度区间出现耐药现象，300-400 μM高浓度重新显著抑制活力。这种双相效应模拟了临床耐药特征。

3.2 Dox诱导缺氧促进耐药

HIF-1α抑制剂KC7F2可增强10-100 μM Dox的细胞毒性，证实该浓度区间耐药由HIF-1α介导。RT-PCR显示缺氧相关基因（Vimentin、GLUT1、Bcl2）表达上调，而凋亡基因Cas3表达失衡。

3.3 高浓度Dox维持HIF-1α表达

免疫染色发现100-400 μM Dox处理后HIF-1α蛋白表达持续升高，CD73酶活性（HIF-1α下游标志）同步增加，表明高浓度Dox在持续缺氧环境下仍能克服耐药。

3.4 通过诱导凋亡克服耐药

高浓度Dox显著激活Cas3并增加TUNEL阳性细胞，表明通过线粒体和核凋亡途径逆转耐药。该现象在MCF7和A549球体模型中得到验证。

3.5 ROS积累与PK2释放的相关性

100-400 μM Dox处理导致ROS水平剂量依赖性升高，且与细胞活力负相关。ELISA检测发现PK2释放与Dox疗效呈正相关，且不受HIF-1α抑制影响，提示其作为缺氧非依赖性生物标志物的潜力。

讨论

3D球体模型成功模拟了Dox临床耐药现象。研究证实10-100 μM浓度Dox通过HIF-1α/CD73途径诱导耐药，而高浓度Dox通过ROS/Cas3凋亡途径克服耐药。PK2作为新型药效学标志物，其释放水平与Dox疗效直接相关，且在乳腺癌和肺癌球体中均呈现一致性表达模式。

研究局限性

研究所用Dox浓度高于临床血药浓度，但考虑肿瘤内药物蓄积特性，该模型仍具有生理相关性。未来需纳入免疫细胞等更多微环境组分，并探索PK2调控机制。

结论

本研究首次提出PK2作为预测Dox疗效的生物标志物，为克服乳腺癌化疗耐药提供了新思路。通过检测PK2水平可前瞻性判断患者对Dox的敏感性，避免无效治疗带来的毒副作用，具有重要临床转化价值。