综述：肺类器官作为分枝杆菌感染建模和药物测试的人类系统

　　本综述系统总结了肺类器官在分枝杆菌感染研究中的应用前景，重点探讨了其作为人类特异性模型在揭示上皮细胞-病原体互作机制、模拟结核分枝杆菌（Mtb）和脓肿分枝杆菌（Mabs）感染过程以及筛选新型治疗靶点方面的独特价值，为抗微生物耐药性（AMR）研究提供了创新平台。

　　

呼吸道的结构与防御机制

呼吸道是由半刚性传导气道组成的复杂系统，从气管起源，经支气管分叉，逐渐狭窄为细支气管，最终形成进行气体交换的肺泡。沿近端-远端轴呈分区化分布，不同区域具有独特的细胞组成：近端气管和支气管区域由假复层上皮构成，含基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞和浆液细胞；远端支气管区域则简化为柱状上皮，包含纤毛细胞、俱乐部细胞、少量基底细胞和杯状细胞。

各气道上皮细胞具有特殊功能：基底细胞是呼吸上皮的主要干细胞群；俱乐部细胞分泌具有免疫调节功能的表面活性液体；杯状细胞产生可捕获污染物和病原体的黏液；纤毛细胞通过纤毛运动实现黏液-纤毛清除功能。肺泡区域覆盖I型肺泡上皮细胞（AEC1）和II型肺泡上皮细胞（AEC2），AEC1呈扁平状促进气体交换，AEC2呈立方状分泌表面活性物质防止肺泡塌陷，并在损伤后分化为AEC1。

上皮细胞构成抵御吸入性病原体的首道屏障，主要防御机制包括：屏障功能、黏液产生、黏液-纤毛清除和细胞自主免疫应答。这些免疫应答涵盖抗菌肽（AMPs）、活性氮物种、活性氧物种（ROS）、生长因子、细胞因子和趋化因子的产生，共同导致白细胞募集增加并与气道壁间充质细胞通信。

黏液是由水、黏蛋白和相关分子组成的细胞外凝胶，其中杯状细胞、俱乐部细胞、浆液细胞和腺体黏液细胞是黏蛋白的主要产生细胞。黏蛋白是大分子糖蛋白，携带多个O-聚糖。黏液-纤毛清除发生在气道表面液体层，包含纤周液体层（PCL）、纤毛和黏液，通过协调调节纤毛运动清除颗粒物。AMPs如乳铁蛋白、cathelicidin、溶菌酶和防御素共同控制细菌增殖。

ROS是上皮细胞响应损伤产生的信号分子，通过破坏微生物膜脂质过氧化和造成DNA损伤发挥直接抗菌作用。DUOX1和DUOX2等NADPH氧化酶介导ROS产生。活性氮物种通过一氧化氮合酶（NOS-1和NOS-2）产生，一氧化氮参与免疫调节和宿主防御。

人类肺类器官用于呼吸道上皮建模

人类疾病研究因生物过程复杂性而充满挑战，科学家采用从二维单细胞培养到动物模型的多种系统。三维细胞培养如组织特异性上皮类器官已成为再现人体组织和器官复杂性特征的有吸引力的系统，同时比体内模型更易于实验操作。

类器官是由多能干细胞（胚胎干细胞ESC或诱导多能干细胞iPSCs）或成体干细胞（ASCs）衍生的三维结构。多能干细胞能分化为所有细胞类型，而成体干细胞具有多能/单能性。成体干细胞存在于完全分化的组织中，能够自我更新，在替换死亡细胞和修复受损组织方面发挥重要作用。

类器官模拟了来源上皮的架构和关键功能，同时保持数年遗传稳定性。建立类器官培养需要为干细胞提供支持分化和自组织的最佳环境，这通过使用支架和富含层粘连蛋白的细胞外基质以及提供复杂的生长因子和抑制剂混合物来实现。类器官在基础研究、疾病建模和再生医学中具有应用价值，其生物样本库在药物筛选和个性化医疗方面具有潜力。

人类肺类器官类型

肺类器官分为三组：近端肺类器官复制传导气道，中间肺类器官对应过渡性呼吸气道，远端肺类器官重现肺泡。近端肺类器官包括气管球或支气管球，由基底肺上皮细胞在气液界面（ALI）三维培养中自组织形成，含P63阳性基底细胞层和面向内腔的管蛋白纤毛细胞。中间肺类器官由细支气管类器官（气道类器官）组成，2017年首次建立长期自我更新方法。远端肺类器官包括肺泡类器官，肺泡上皮显示两种主要细胞类型：AEC1和AEC2。立方状AEC2作为组织干细胞，能分化为AEC1，分泌肺表面活性物质；扁平状AEC1构成大部分肺泡表面，直接确保气体交换。

其他肺类器官模型包括人鼻上皮类器官（HNEO）和完全肺类器官模型（支气管肺泡模型）。HNEO从患者鼻刷样本生成，显示黏液纤毛细胞组成和液体分泌范围与气道类器官不同。完全肺类器官模型从支气管树活检发展而来，显示近端和远端气道上皮，可扩展、可传代、个性化且成本效益高。

分枝杆菌感染示例：结核分枝杆菌

结核病（TB）仍是单一病原体导致死亡的主要原因，2023年全球1080万人患病，约125万人死亡。结核分枝杆菌（Mtb）通过气溶胶微滴人际传播，5-15%感染者会在数月或数年内发展为活动性疾病。标准治疗为6-9个月四种抗生素（利福平、异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇）方案，但药物敏感性结核治疗成功率88%，耐药结核出现降低治疗效果。

Mtb感染过程中遇到各种肺内环境，细胞外环境与气道上皮和肺泡区域相互作用，细胞内环境在被肺泡巨噬细胞（AM）吞噬后建立原发感染。上皮细胞在感知细菌和警报/与免疫细胞相互作用方面至关重要，表达多种模式识别受体检测微生物，包括TLR2、TLR4、TLR9、NOD2、Dectin-1和补体受体3（CR3），激活不同信号通路导致多种细胞因子产生。

上皮细胞直接感染分枝杆菌，一些上皮跨膜受体如整合素和Dectin-1与Mtb细胞表面效应分子相互作用，包括粘附素苹果酸合酶、ESAT-6和肝素结合血凝素（HBHA），有利于Mtb摄取。一旦进入上皮细胞，Mtb定位于非酸性晚期内体，允许细菌存活。上皮细胞在感染后分泌促炎细胞因子、趋化因子和组织生长因子，吸引中性粒细胞到感染细胞顶端部分。

非结核分枝杆菌感染示例：脓肿分枝杆菌

非结核分枝杆菌（NTM）肺部感染在全球传播，其中脓肿分枝杆菌（Mabs）是对人类肺部感染最挑战的NTM之一。Mabs感染治疗成功率很低，最高仅50%，当前治疗方案需要18个月的多药治疗。囊性纤维化（CF）是Mabs感染的重要风险因素，CF患者更易被Mabs定植和感染。

囊性纤维化是单基因疾病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起。CFTR编码阴离子通道，主要功能是运输氯离子和碳酸氢盐，调节上皮钠通道（ENaC）功能和水交换。CFTR突变分为七类，最常见的是ΔF508 CFTR突变。缺陷CFTR影响多个系统，呼吸系统是主要受影响系统，后果包括黏液脱水、黏液纤毛清除受损、黏液积聚、炎症、氧化应激、细胞因子和趋化因子释放、中性粒细胞和巨噬细胞募集以及机会性病原体慢性感染。

Mabs是毒力最强的快速生长分枝杆菌，显示两种明显形态型：光滑（S）变体和粗糙（R）变体。S变体能动、形成生物膜、不产生索状结构；R变体不能动、形成索状、非或超聚集性/僵硬生物膜形成。关键区别在于表面糖肽脂（GPLs）数量，R形式显示表面相关GPLs显著减少。GPLs在Mabs生物膜形成和进一步肺定植中起重要作用，具有免疫惰性，能屏蔽细菌细胞壁生物活性分子。

囊性纤维化相关分枝杆菌感染的肺类器官建模

2013年首次使用类器官模拟CF，CF患者来源肠道类器官生成和表征，重现CF疾病主要特征。应用毛喉素诱导肿胀 assay，健康类器官通过cAMP刺激（毛喉素-cAMP信号诱导CFTR通道活性）将液体导入腔内诱导类器官肿胀，CFTR功能丧失的CF患者类器官不肿胀。

最近创建其他类器官模型用于CF研究，如气道类器官和HNEO。CF气道类器官可从患者肺切除（肺移植后）或支气管肺泡灌洗液生成，CF患者携带F508del突变的气道类器官显示继发表型如黏液积聚和异常毛喉素诱导肿胀。CF HNEO从鼻刷易生成，显示狭窄腔面积和缺陷肿胀。

应用人类气道类器官技术模拟CF环境中Mabs感染，显示CF来源气道类器官有更厚上皮、积聚黏液、经历氧化应激、增加脂质过氧化和细胞死亡，这些都是CF关键特征。Mabs S和R在CF患者类器官中比健康类器官更有效复制，Mabs S形成生物膜，Mabs R形成索状显示更高毒力。增强抗氧化途径与抗生素头孢西丁联合减轻CF气道类器官氧化应激，支持更好控制Mabs感染。

人类肺类器官模型的优势与局限

人类肺类器官是研究呼吸道感染的优势模型，是模仿人类肺不同部分架构和基本功能的复杂多细胞系统，可冷冻保存在生物样本库中保持数年遗传稳定，易于操作、可靠且可扩展。局限性包括缺乏血管化和免疫细胞、由于囊状形式缺乏气液界面、封闭架构限制访问顶侧上皮表面。

类器官领域仍在发展，最新进展如类器官与免疫/基质细胞共培养协议改进、生成可访问极化假复层上皮的类器官来源ALI培养、器官芯片技术复制人体循环、微注射技术实施和顶侧外类器官生成，已采用以克服类器官局限性。

结论

上皮细胞在分枝杆菌感染早期阶段起决定性作用，通过细胞自主防御机制直接清除细菌或与其他免疫细胞如巨噬细胞交叉对话。肺类器官模型作为有前景的技术，可提高我们对呼吸道中宿主-分枝杆菌相互作用的理解，破译新治疗方法。尽管少数研究评估肺类器官在分枝杆菌感染研究中的潜在应用，该技术看起来有希望，可帮助解决分枝杆菌领域未解决的问题。

通过结合先天免疫细胞如肺泡巨噬细胞与人类肺类器官，这些模型可实施测试针对细胞内和/或细胞外细菌以及宿主反应的创新治疗策略，作为经典人类细胞系或动物模型的补充方法，以对抗分枝杆菌中的抗微生物耐药性。