明胶改性可生物降解聚氨酯泡沫的体外表征及其在创伤止血与再生中的应用研究

　　本综述系统探讨了通过简便物理与化学方法将生物活性明胶（gelatin）整合至可生物降解聚氨酯（PUr）泡沫中，显著增强其促凝血特性与细胞相互作用。改性后的泡沫展现出更快凝血时间、增强血小板附着与纤维蛋白沉积，以及促进成纤维细胞附着、铺展与增殖的能力，为创伤止血和组织再生提供了高效可降解支架，具有重要临床转化潜力。

　　

1 引言

聚氨酯（PUr）泡沫因其生物相容性、血液相容性、耐久性及易规模化生产等特点，被广泛探索用于栓塞、止血和组织工程应用。其可调的孔隙结构、力学性能和降解速率使其成为血栓形成和细胞浸润的理想支架。然而，传统PUr泡沫完全由合成材料制成，限制了其促进组织再生的长期愈合能力。为改善PUr驱动的愈合效果，本研究探索通过简单的物理和化学方法在泡沫制备后将生物活性明胶引入可生物降解PUr泡沫中。

2 方法

2.1 材料

所有化学品和试剂均购自Fisher Scientific和Sigma Aldrich等公司，并按收到状态使用。猪全血购自Lampire Biological Laboratories。

2.2 基于凝血分析的可降解泡沫初步筛选

通过直接灌注模型评估三种快速降解泡沫配方（30T-1,2、30T-2,2和30H-2,2）的凝血行为。30T-2,2泡沫因最佳凝血表现被选为后续研究的“可生物降解”泡沫。

2.3 可降解聚硫醇的合成

按先前描述的方法合成可降解聚硫醇，使用ATR-FTIR和¹H NMR光谱确认最终产物。

2.4 泡沫合成

“生物稳定”对照PUr和“可生物降解”30T-2,2 PUr泡沫按已发表方法制备。泡沫在真空下干燥后进行所有表征和分析。

2.5 明胶的物理掺入

将明胶溶解在DPBS中，通过孵育和冲洗步骤将其物理吸附到PUr泡沫上。

2.6 甲基丙烯酸化明胶的化学掺入

制备甲基丙烯酸化明胶（gelMA），并通过紫外光固化将其化学交联到PUr泡沫中。

2.7 光谱分析

使用ATR-FTIR光谱仪分析泡沫截面表面化学，确认明胶和gelMA的掺入。

2.8 泡沫孔隙结构

通过SEM成像分析孔隙形态和掺入的生物活性组分，使用ImageJ和GIMP量化孔径和孔隙互连性。

2.9 密度

通过质量和体积计算圆柱形泡沫样品的密度。

2.10 热分析

使用DSC测量干态和湿态（塑化）泡沫样品的玻璃化转变温度（T_g）。

2.11 力学测试

测量干态和湿态样品的压缩模量，应变速率控制在?1 mm/min。

2.12 溶胀比

通过测量干质量和溶胀质量计算溶胀比（SR）。

2.13 体外降解

在3% H₂O₂中进行45天降解研究，定期测量质量损失并记录侵蚀剖面。

2.14 血液-材料相互作用

2.14.1 溶血

测试泡沫样品在猪全血中的溶血性，确保不会破裂红细胞（RBCs）。

2.14.2 血液吸收

测定泡沫样品在猪全血中的吸收能力。

2.14.3 血小板附着

使用LDH细胞毒性测定试剂盒量化血小板附着到PUr泡沫上的数量。

2.14.4 凝血时间

通过凝血测定评估泡沫样品的凝血时间，基于游离血红蛋白的吸光度。

2.14.5 动态血流下的凝血

2.14.5.1 直接灌注体外流动模型

使用先前描述的灌注模型研究动态血流下生物活性组分对泡沫诱导凝血的影响。

2.14.5.2 血小板成像

通过SEM成像观察血小板形态和激活状态。

2.14.5.3 组织学分析

通过H&E和PTAH染色分析纤维蛋白沉积，使用显微镜成像和GIMP量化。

2.15 细胞-材料相互作用

2.15.1 细胞相容性

使用NIH/3T3小鼠成纤维细胞通过alamar blue测定评估细胞活力。

2.15.2 细胞附着

通过荧光显微镜观察和计数GFP标记细胞的附着情况。

2.15.3 细胞铺展

通过荧光染色和SEM成像分析细胞铺展和形态，使用图像分析量化细胞覆盖面积。

2.16 统计分析

使用Student's t-检验进行统计分析，p?

3 结果

3.1 生物活性组分的掺入

FTIR光谱和SEM显微照片证实了明胶和gelMA成功掺入PUr泡沫。明胶的物理吸附表现为珠状结构，而gelMA的化学掺入导致更光滑的闭孔结构，孔隙互连性降至0%。gelMA样品平均孔径减小，可能与干燥后收缩有关。

3.2 物理、热和力学分析

未改性生物稳定和可生物降解泡沫具有可比密度。明胶和gelMA改性样品密度显著增高，gelMA样品密度最高。明胶泡沫溶胀比略有增加，而gelMA泡沫溶胀显著降低。可生物降解泡沫在干湿状态下玻璃化转变温度均显著低于生物稳定泡沫，但明胶和gelMA改性未显著影响热性能。未改性可生物降解泡沫在干态下压缩模量显著较低，但gelMA掺入使其模量增至与生物稳定泡沫相当。在湿态下，未改性可降解泡沫模量较低，明胶改性进一步降低压缩模量。

3.3 体外降解

在3% H₂O₂中进行的45天降解研究表明，生物稳定泡沫中，未改性样品45天后剩余质量约74%，而明胶和gelMA样品分别剩余约55%和40%。可生物降解泡沫降解更快，所有样品45天后剩余质量仅4%–5%。所有泡沫均经历表面侵蚀，生物稳定泡沫结构保持完整，而可生物降解泡沫尺寸显著减小。

3.4 静态血液-材料相互作用

所有泡沫均无溶血性（<1.5%溶血）。除明胶生物稳定泡沫外，所有泡沫血液吸收能力相当。明胶和gelMA生物稳定泡沫血小板附着显著多于未改性生物稳定泡沫，未改性可生物降解泡沫也表现出更高血小板附着。凝血测定显示，明胶和gelMA改性泡沫在6分钟内游离RBCs显著减少，12分钟内可生物降解泡沫及其改性样品游离RBCs进一步减少，12–18分钟间达到稳定凝血状态。

3.5 动态血液-材料相互作用

灌注运行中血液吸收趋势与静态条件相似。明胶的促凝血性质增强了明胶和gelMA生物稳定泡沫的凝血能力，表现为通过样品的流体减少（流出容器收集）和绕道流体增加（溢出容器收集）。未改性可生物降解泡沫凝血显著优于未改性生物稳定泡沫，因此明胶和gelMA对可生物降解泡沫的增强作用较小。流动速率分析表明，未改性和明胶生物稳定泡沫在最初2分钟内溢出容器流速最大增加，之后减慢/平台化，表明稳定血凝块约在2分钟形成。gelMA生物稳定和未改性可生物降解泡沫约在1.5分钟，明胶和gelMA可生物降解泡沫约在1分钟达到此状态，表明止血时间更快。尽管凝血和血流重定向增加，各样品间压差保持相似。

灌注后样品分析显示，未改性生物稳定泡沫疏水表面促进血小板附着、激活和聚集。未改性可生物降解泡沫更疏水，增加血小板相互作用，形成更大血小板聚集体和纤维蛋白沉积。明胶的物理和化学掺入进一步增强了泡沫的血小板相互作用，明胶和gelMA生物稳定泡沫样品血小板覆盖和聚集体更多。可生物降解明胶泡沫纤维蛋白最多。gelMA生物稳定泡沫有些血小板激活并有小丝状伪足（filopodia），而gelMA可生物降解泡沫大多数血小板显著激活并有更明确丝状伪足，尤其在近端和中端。

组织学染色显示，未改性生物稳定泡沫纤维蛋白沉积显著少于其他泡沫 throughout其体积。所有其他泡沫样品体积内均存在纤维蛋白，近端最多，血液首先接触样品并启动凝血。有趣的是，未改性可生物降解泡沫纤维蛋白沉积与生物活性生物稳定泡沫相当，表明无需额外促凝血剂即可有效凝血。但明胶可生物降解泡沫纤维蛋白沉积显著多于未改性可生物降解泡沫，表明明胶进一步改善凝血。

3.6 细胞-材料相互作用

所有泡沫高度细胞相容，24、48和72小时细胞活力>90%，符合ISO 10993生物相容性标准。z-stack合并明场和GFP图像显示细胞附着于泡沫整体。未改性生物稳定和可生物降解泡沫最初有些细胞附着，但这些细胞在72小时研究期内未增殖。相反，明胶和gelMA泡沫（生物稳定和可生物降解）24小时时更多细胞初始附着，这些细胞在72小时内增殖。

DAPI（核，蓝）和phalloidin（肌动蛋白，红）染色合并图像支持GFP细胞结果，未改性泡沫72小时时细胞附着较少，而明胶和gelMA泡沫显示细胞附着增加。定性上，生物活性泡沫随时间细胞铺展增加（红染肌动蛋白增加）。为确认此发现，对SEM图像进行定量分析以消除泡沫自发荧光潜在不准确性。

虽然DAPI和phalloidin染色确认每个成纤维细胞核和肌动蛋白结构，SEM显微照片更详细显示细胞与泡沫相互作用。与GFP和DAPI/phalloidin图像一致，SEM图像显示未改性生物稳定和可生物降解泡沫24、48和72小时 few细胞附着。细胞主要 balled up，细胞质铺展少。明胶和gelMA泡沫细胞铺展和覆盖泡沫孔隙显著更高。生物活性生物稳定泡沫上，成纤维细胞纺锤形，有些细胞间相互作用。生物活性可生物降解泡沫上，成纤维细胞更扁平，细胞间相互作用更多。生物活性可生物降解泡沫细胞铺展和相互作用显著增加，与FTIR光谱观察到的明胶吸收增加相关。

4 讨论

本研究对改善未控制出血和创伤组织重塑的伤口愈合治疗具有高潜力。可进一步扩展至更广栓塞应用。虽然组织修复和细胞相互作用可能与血管闭塞不太相关，但本研究中明胶改性PUr泡沫可通过减少形成血栓时间改善当前栓塞治疗，完全合成PUr泡沫仅依赖物理性质诱导血栓。

伤口愈合是复杂过程，涉及四个阶段：止血、炎症、增殖和重塑。止血在损伤后立即发生，通过血小板聚集和凝血形成停止出血。炎症持续最多一周，中性粒细胞和巨噬细胞清除病原体并释放细胞因子促进组织修复。增殖阶段在1–3周内，涉及再上皮化、血管生成和肉芽形成以重建ECM和组织。重塑可耗时数月到数年，通过胶原交联和组织成熟强化伤口。严重出血和创伤损伤中，身体需要额外止血剂或设备稳定出血并确保适当伤口愈合。

组织工程支架可进一步促进伤口修复和组织再生。明胶基止血敷料有效控制出血，但受限于差力学性能和降解控制差。PUr基止血敷料可改善这些限制，因其可调孔隙结构、力学性能和降解速率。它们控制出血非常有效，且 inexpensive、易消毒、制造和规模化商业化。尽管对PUr敷料和明胶敷料用于出血控制研究广泛，对PUr-明胶混合敷料用于止血应用研究有限。Guo等人开发了电纺明胶改性PUr海绵库，在大鼠肝创伤模型中证明成功止血；但这些PUr还包含化学掺入止血剂，包括氨甲环酸（抑制纤维蛋白降解并促进凝血）和腺苷二磷酸（诱导血小板聚集促进凝血）。

有大量研究 into PUr-明胶电纺支架用于组织工程应用：Han等人开发了含明胶和角蛋白的PUr电纺mat，释放硫化氢促进细胞增殖和血管生成；Letha等人合成了由PUr和明胶层组成的电纺皮肤支架，分别模拟表皮和真皮层；Abolhassani等人设计了负载蜂蜜和氧化锌的电纺PUr-明胶敷料，增加伤口抗菌活性。虽然所有这些电纺PUr-明胶支架为组织重塑设计，但它们作为止血剂的用途未探索。此外，电纺有许多限制可能阻碍其商业应用，包括低生产 yield和高生产成本、纤维直径和排列不一致、差机械强度和差细胞浸润。本工作中讨论的明胶改性PUr敷料为实现止血和促进细胞相互作用以 potential组织重塑提供了 novel伤口愈合治疗选项。可降解聚硫醇使用快速、无溶剂合成方法制作，允许其立即掺入PUr泡沫。然后PUr泡沫在泡沫制备后易用明胶改性。泡沫合成和表面改性简易性可显著改善高效和经济伤口敷料的临床转化可扩展性。

本工作证明PUr和明胶敷料联合效应可进一步改善伤口愈合结果。本工作中探索的生物稳定和可生物降解PUr泡沫先前证明优秀止血能力，与市售QuikClot Combat Gauze（QCCG）相比显著改善。PUr泡沫用明胶和gelMA简单改性进一步增强泡沫诱导凝血，导致增加血小板附着、更快凝血时间、增加凝血行为、更大血小板激活和增加纤维蛋白沉积。此外，这些生物活性可生物降解PUr泡沫体外凝血性能优于类似止血PUr系统。而且，明胶和gelMA PUr泡沫 exhibited显著增加细胞附着、铺展和成纤维细胞在PUr泡沫孔隙上增殖，使其能够用作促进伤口愈合增殖和重塑阶段的组织工程支架。虽然本工作中仅探索两种不同PUr配方，但简便改性策略可应用于一系列潜在泡沫配方后制备，无需改变既定泡沫化学或发泡过程。

5 结论

本工作提供了改善可生物降解PUr泡沫生物活性的简单方法，用于各种组织支架应用，包括创伤止血和愈合。明胶的物理和化学掺入到PUr泡沫中显著改善泡沫血液和细胞材料相互作用体外。明胶改性PUr泡沫中证明的增加血小板附着、激活和聚集，以及增加纤维蛋白沉积，可最终减少实现血栓时间用于栓塞治疗和创伤止血。类似地，生物活性支架上细胞附着、铺展、增殖和细胞间相互作用增加可增强其组织工程伤口重塑能力。未来体内研究需要确认这些体外发现。最终，这些PUr泡沫用明胶简便改性可提供有效、经济敷料，易规模化以改善栓塞和止血治疗及整体伤口愈合结果。