miR-106a-5p靶向SFRP2通过Wnt/β-catenin通路调控Perthes病骨再生与成骨分化的机制研究

　　本研究揭示了miR-106a-5p/SFRP2轴在Perthes病骨再生中的关键作用。通过体内外实验证实SFRP2可促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和成骨分化，抑制凋亡，并激活Wnt/β-catenin通路（Wnt3a、β-catenin、LRP5/6）。miR-106a-5p通过靶向抑制SFRP2负向调控这一过程。该机制为Perthes病的靶向治疗提供了新策略。

　　

引言

Perthes病是一种儿童股骨头缺血性坏死的疾病，其发病机制尚不明确，但股骨头缺损区域的骨再生机制备受关注。该病由于股骨头血供减少导致，常引起髋关节畸形和早发性退行性关节炎，致残率较高。目前缺乏有效治疗方法，主要治疗目标是恢复股骨头球形结构和改善头臼匹配度。由于病理机制不清，理解骨再生机制并加速骨修复至关重要。

分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）在骨和软骨生长发育中起关键作用。研究表明，SFRP2在儿童肢体发育中表达显著上调，其缺失会导致软骨细胞增殖减少和分化延迟，引起并指和短指畸形。de Castro等人发现SFRP2在骨愈合过程中对成体骨骼干细胞（SSCs）的自我更新、募集和分化起重要作用，敲除SFRP2基因会明显抑制骨髓基质细胞（BMSCs）和SSCs的成骨分化。这些发现表明SFRP2能促进干细胞成骨分化。在未成熟兔Perthes病模型研究中，RNA测序（RNA-seq）也显示修复期股骨头中SFRP2表达显著增加。

微小RNA（miRNA）是短内源性非编码RNA，通过转录后抑制特定靶mRNA调控多种生物学过程。现有证据表明miR-106a-5p在调节骨软骨发育和维持骨稳态中起重要作用。Hui等人发现青少年特发性脊柱侧凸患者的BMSCs中miR-106a-5p显著上调，认为这与骨量丢失有关。这些发现表明miR-106a-5p能抑制成骨前体细胞分化。实验数据也显示miR-106a-5p可能对成骨有抑制作用。此外，TargetScan数据库预测了miR-106a-5p与SFRP2 mRNA-3′UTR的直接结合位点，表明miR-106a-5p/SFRP2轴可能调控成骨和骨再生。

基于miR-106a-5p与SFRP2的可能相互作用，我们假设SFRP2在被miR-106a-5p靶向后（通过Wnt/β-catenin通路）能促进成骨前体细胞成骨分化并加速缺损股骨头的骨再生。因此，miR-106a-5p/SFRP2轴被认为是Perthes病的潜在治疗靶点。

材料与方法

本研究经贵州医科大学医学伦理委员会批准（批准号：2201637）。按先前描述的方法分离和培养原代兔BMSCs。从8周龄兔的股骨和胫骨干骺端抽取骨髓，采用密度梯度离心法获取BMSCs，接种于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的完全DMEM培养基中，37°C、5%二氧化碳培养，每3天换液。通过光镜进行BMSCs形态学鉴定，流式细胞术验证细胞表型，第三代细胞用于后续实验。

细胞转染按制造商协议进行。BMSCs和MC3T3-E1细胞以1×10⁵个/mL密度接种于24孔板，细胞融合度达60%–80%时，用Lipofectamine 2000试剂转染质粒。过表达SFRP2质粒载体（oe-SFRP2）、空白阴性对照质粒载体（NC）、靶向SFRP2的短发夹RNA质粒载体（sh-SFRP2）、miR-106a-5p模拟物（5′-GAUGGACGUGACAUUCGUGAAAA-3′）和miR-106a-5p抑制剂（5′-CAAACACCUUACACACCAGG UAG-3′）由广州锐博生物科技有限公司合成。简要而言，将0.8–1.0 μg oe-SFRP2、sh-SFRP2、miR-106a-5p模拟物和抑制剂分别稀释于50 μL DMEM中；将1–3 μL Lipofectamine 2000试剂也稀释于50 μL DMEM中，室温放置4小时。将稀释的DNA和Lipofectamine 2000试剂混合，室温孵育4小时，然后加入细胞中孵育2小时。继续在DMEM中培养48小时（37°C、5%二氧化碳）后，用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot评估转染效率。

为诱导成骨分化，将BMSCs和MC3T3-E1细胞接种于12孔板，加入含0.2 mM抗坏血酸、100 nM地塞米松和10 mM β-甘油磷酸的成骨特异性诱导培养基，每3天更换培养液。细胞在指定时间点收集和分析。

EdU染色使用BeyoClickEdU-594检测试剂盒进行。细胞以5×10⁵个/孔接种于6孔板培养24小时，然后与100 μM EdU孵育2小时。细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，0.5% Triton X-100透化15分钟。用Hoechst 33342进行核染色，甲醇和磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤20分钟。染色后，每视野计数细胞数，并用IPP 6.0软件定量分析。

细胞以1×10⁶个/孔接种于6孔板，成骨诱导培养基中培养7天。调整细胞密度至5×10⁶/mL，用PBS洗涤后，按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明直接加入5 μL Annexin V/FITC和5 μL碘化丙啶。轻轻涡旋后室温避光孵育15分钟，然后进行流式细胞术分析。

TUNEL assay按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明进行。细胞以1×10⁶个/孔接种于6孔板，成骨诱导培养7天后，用4%多聚甲醛固定20分钟。PBS洗涤15分钟，0.2% Triton X-100孵育5分钟。PBS洗三次后，与56 μL反应液（酶和标记溶液混合）在37°C孵育1小时。室温PBS洗涤20分钟，与100 μL苏木精（Servicebio, China）在37°C孵育30分钟。盖上盖玻片，荧光显微镜（Leica, Germany）下拍照。10个随机视野计数至少100个细胞，计算阳性凋亡细胞百分比。

ALP染色按ALP染色试剂盒说明进行。成骨诱导7天后，细胞室温用4%多聚甲醛固定20分钟。PBS洗涤后，拍照记录染色细胞板，用酶标仪（Molecular, USA）在405 nm测量吸光度值以量化ALP活性。ARS染色中，成骨诱导28天后细胞用4%多聚甲醛固定20分钟。矿化结节与40 mM茜素红S染料（Macklin, China）在37°C孵育20分钟。拍照记录染色细胞板，染料溶于10%十六烷基吡啶氯化物。用酶标仪（Molecular, USA）在562 nm定量提取液吸光度。

用双荧光素酶报告基因 assay验证miR-106a-5p与SFRP2的交互关系。用TargetScan数据库预测miR-106a-5p在SFRP2 3′UTR的推定结合位点。 assay按Dual-glo双荧光素酶测试试剂盒说明进行。野生型（WT）和突变型（MUT）SFRP2 3′UTR载体由锐博生物科技有限公司构建。宿主293T细胞接种于96孔板，培养指定报告构建体和Renilla荧光素酶质粒。转染24小时后按说明书用荧光分光光度计测量荧光素酶活性。相对转录活性标准化为相应载体对照值。

用TRIzol试剂从细胞或骨组织提取总RNA。用分光光度计测量RNA浓度和光密度（1.8–2.1），1% E-GelEX琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser将总RNA逆转录为cDNA。用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus kit进行qPCR；本研究使用的PCR引物序列见表1。相对RNA标准化为内源性β-actin或U6，qPCR使用7500实时PCR系统，SYBR green，热循环条件如下：95°C 5分钟，95°C 10秒，60°C 30秒，72°C 30秒，共35个循环。用2^?ΔΔCq法计算实验组与对照组之间的相对表达变化倍数。

用放射免疫沉淀测定缓冲液和完全蛋白酶抑制剂裂解细胞或骨组织。BCA蛋白 assay定量后，样品用SDS-PAGE分离，并按标准过程转移到PVDF膜上。膜用脱脂奶封闭，4°C overnight与抗SFRP2、抗PCNA、抗Bax、抗Bcl-2、抗Osterix、抗Runx2、抗Col1a1、抗ALP、抗Wnt3a、抗β-catenin、抗LRP5和抗LRP6抗体孵育。用Image J软件对印迹进行定量分析。

8周龄新西兰白兔由济南金丰实验动物有限公司提供（编号：SCXK20180006）。在25°C室温适应性饲养7天，相对湿度55%。自由饮水，12小时光暗循环。本研究所有程序符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南建议（2020/第三版）。含AAV-zsGreen-SFRP2（Ad-SFRP2）和miR-106a-5p agomir的腺相关病毒载体由广州锐博生物有限公司合成。兔随机分为五组：对照组（正常）、模型组、miR-106a-5p agomir组、Ad-SFRP2组和Ad-SFRP2 + miR-106a-5p agomir组，每组5只。简要而言，兔用腹腔注射戊巴比妥钠麻醉。通过切开股骨头圆韧带并用弹性不可吸收缝线结扎股骨颈制作Perthes病兔模型，阻碍骨骺血流。术后2周向股骨头注射Ad-SFRP2（1×10⁸ GC）和miR-106a-5p agomir（20 nmol）；对照组和模型组使用等量盐水。术后8周处死兔，取股骨头用于后续实验。

术后第8周基于视觉形态学评估股骨头。评估大小、球形完整性和是否存在塌陷；同时评估关节软骨的光滑度、颜色和厚度。

股骨头分析前用4%多聚甲醛固定2天。用微CT成像系统（电压70 kV，分辨率8 mm）评估。分析小梁骨的以下参数：骨体积/总体积、骨矿物质密度（mg/cc）、骨矿物质含量（mg）、小梁数量（/mm）、小梁厚度（mm）、小梁间距（mm）和连接密度（/mm³）。

微CT分析后，股骨头用4%多聚甲醛固定，10% EDTA脱钙，流水冲洗。脱钙组织脱水、透明、石蜡包埋后切片4 μm。ALP染色按2.7节描述进行，测量吸光度值定量。苏木精和伊红染色计数空骨陷窝比例，免疫组化染色用抗SFRP2抗体鉴定SFRP2阳性细胞。

用SPSS软件23.0进行统计分析。定量数据以均值±标准差（SD）表示，Kolmogorov–Smirnov检验评估分布正态性。不同组间方差用F检验比较，组间比较用非配对Student t检验或Mann–Whitney U检验。三组及以上时，方差分析后行Tukey事后检验；p < 0.05认为显著。

结果

3.1 SFRP2促进BMSCs和MC3T3-E1细胞增殖并抑制凋亡

RT-qPCR验证RNA测序结果，证实兔模型缺损股骨头（模型组）中SFRP2表达上调。用相应慢病毒载体转染BMSCs和MC3T3-E1以进一步研究SFRP2对细胞增殖和凋亡的调节作用。RT-qPCR和Western blot证实转染效率。EdU染色显示细胞增殖显著增加；oe-SFRP2组PCNA表达也显著高于NC组。然而，流式细胞术和TUNEL assay显示细胞凋亡显著抑制；oe-SFRP2组Bax表达下调，Bcl-2表达上调。而sh-SFRP2组结果相反。这些结果表明SFRP2能促进成骨前体细胞增殖并抑制凋亡。

3.2 SFRP2通过Wnt/β-catenin通路增强BMSCs和MC3T3-E1细胞成骨分化

然后评估SFRP2对BMSCs和MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。成骨分化第7天ALP染色强度最高，此时活性也最强。第28天ARS染色显示oe-SFRP2组钙化结节数量和染色强度高于其他组。此外，RT-qPCR和Western blot显示oe-SFRP2组成骨分子（ALP、Col1a1、Runx2和Osterix）表达显著增加。为探索SFRP2是否通过经典Wnt/β-catenin通路（已证明对成骨分化至关重要）影响成骨过程，用RT-qPCR和Western blot评估相关生物标志物。结果表明oe-SFRP2组Wnt3a、β-catenin、LRP5和LRP6表达显著增加。而sh-SFRP2组结果相反。这些发现表明SFRP2通过Wnt/β-catenin通路增强成骨前体细胞成骨分化。

3.3 SFRP2是miR-106a-5p的直接靶基因，受其负调控

为验证RNA测序结果，用RT-qPCR证实缺损股骨头（模型组）中miR-106a-5p表达下调。此外，用miR-106a-5p模拟物和miR-106a-5p抑制剂转导BMSCs以进一步探索miR-106a-5p对SFRP2的调节作用。然后在成骨分化第0、7、14和28天用RT-qPCR和Western blot评估miR-106a-5p和SFRP2的表达谱。结果表明miR-106a-5p模拟物组SFRP2表达显著下调，而miR-106a-5p抑制剂组显著上调，且呈时间依赖性。为进一步确认miR-106a-5p与SFRP2的交互作用，将miR-106a-5p模拟物与oe-SFRP2共转导。miR-106a-5p模拟物组转染24小时后SFRP2表达显著降低；此外，miR-106a-5p模拟物 + oe-SFRP2组显示SFRP2可挽救miR-106a-5p的调节作用。然后进行双荧光素酶报告基因 assay以进一步阐明miR-106a-5p与SFRP2的交互作用。也用TargetScan数据库预测miR-106a-5p与SFRP2 3′UTR的结合位点。 assay显示miR-106a-5p模拟物抑制SFRP2 3′UTR WT荧光素酶报告活性，但不抑制SFRP2 3′UTR MUT报告活性。这些结果共同表明SFRP2是miR-106a-5p的直接靶基因，受其负调控。

3.4 miR-106a-5p负调控SFRP2通过Wnt/β-catenin通路抑制增殖和成骨分化并促进细胞凋亡

为进一步确认SFRP2作为miR-106a-5p调节细胞增殖、凋亡和成骨分化的介质，将BMSCs与oe-SFRP2、miR-106a-5p模拟物及其对照共转染，然后在成骨培养基中培养。RT-qPCR和Western blot结果显示miR-106a-5p模拟物组PCNA、Bcl-2、ALP、Col1a1、Runx2和Osterix表达显著降低，而Bax表达显著增加；然而oe-SFRP2组结果相反。此外，在miR-106a-5p模拟物 + oe-SFRP2组中SFRP2可挽救miR-106a-5p的调节作用。

3.5 SFRP2加速兔模型骨再生并减少股骨头畸形

用Ad-SFRP2和miR-106a-5p agomir处理兔模型缺损股骨头以进一步验证体外结果。缺损股骨头宏观形态学观察显示典型表现，与模型组相似。Ad-SFRP2组股骨头无塌陷信号，球形结构良好；软骨表面光滑有光泽。股骨头畸形显著减少，微CT分析显示骨体积/总体积、小梁骨骨矿物质密度、小梁骨骨矿物质含量、连接度和连接密度显著改善。苏木精和伊红染色评估显示空骨陷窝比例显著降低，ALP染色显示活性明显增加。免疫组化染色显示Ad-SFRP2组SFRP2阳性细胞数量较模型组和miR-106a-5p agomir组显著增加。值得注意的是，在Ad-SFRP2 + miR-106a-5p agomir组中SFRP2可挽救miR-106a-5p对成骨分化的抑制作用。这些结果证实了SFRP2在加速Perthes病兔模型骨再生和减少股骨头畸形中的作用。

讨论

Perthes病的发病机制和骨再生机制尚不清楚。由于临床难以获取缺损股骨头标本，动物模型是研究潜在机制的最佳替代方案。先前使用RNA-seq的研究显示未成熟兔模型修复期股骨头中SFRP2和miR-106a-5p差异表达。本研究结果证明了miR-106a-5p/SFRP2轴在调节成骨前体细胞成骨分化和骨再生中的新作用。

SFRP家族由哺乳动物分泌糖蛋白组成，各成员通过不同机制在不同组织中执行各种生物学功能；包括关节面生长发育和各种疾病的发生进展。SFRP2是SFRP家族的重要成员，调节许多疾病的病理过程。Morello和Ikegawa等人表明SFRP2在肢体发育中显著上调，SFRP2缺失可能导致并指和短指畸形。Lin等人用IGF-1载体转染BMSCs，发现SFRP2增加BMSCs活性和增殖能力，抑制凋亡，并改善心肌梗死后的修复和再生能力。de Castro等人也发现敲除小鼠SFRP2基因显著抑制BMSCs和SSCs的体外成骨分化。Cho等人证实SFRP2能促进小鼠BMSCs体外成骨分化。它还能显著增强β-甘油磷酸和抗坏血酸诱导的ALP活性并激活Wnt/β-catenin/TCF传导。然而，某些研究报告了 conflicting 结果。Kim和Sathi等人发现多发性骨髓瘤细胞分泌的SFRP2通过Wnt/β-catenin通路抑制成骨前体细胞分化和骨形成。在此背景下，SFRP2被认为是Wnt/β-catenin通路的重要上游调节因子，在骨发育和骨稳态中起重要作用。因此我们进一步探索了SFRP2与Wnt/β-catenin通路的关系。与先前研究结果一致，我们的结果表明SFRP2能促进BMSCs和MC3T3-E1细胞增殖，抑制凋亡，通过Wnt/β-catenin通路增强成骨分化，加速骨再生，并减少缺损股骨头畸形。

成骨分化和骨再生是长期复杂的生物学过程，也受表观遗传因素调控。miRNA广泛参与骨骼生长和骨关节病（如骨质疏松和骨坏死）的进展。近年来，miR-106a-5p被证明在调节骨软骨发育和维持骨稳态中起重要作用。Wu等人发现含破骨细胞来源miR-106a-5p的外泌体能增强BMSCs成骨分化并加速骨缺损修复。然而，Hui等人筛选青少年特发性脊柱侧凸患者BMSCs的microRNA差异表达谱，发现miR-106a-5p显著上调，推测miR-106a-5p具有成骨抑制作用，与骨量丢失有关。Peltzer人也认为在干扰素-γ影响下BMSCs来源的miR-106a-5p对成骨有抑制作用。此外，Xiang等人发现miR-106a-5p在成骨培养基中抑制人牙周韧带干细胞成骨分化和矿化。本研究中，我们将Ad-SFRP2和miR-106a-5p agomir注射到股骨头软骨下骨区域。选择该位置是为了最大限度地直接递送到骨髓微环境中的成骨前体细胞，这些细胞对骨再生至关重要。与这些发现一致，我们的结果表明miR-106a-5p减少成骨前体细胞增殖，增加凋亡，抑制体外成骨分化，并延迟缺损股骨头体内修复性骨再生。我们还证实miR-106a-5p对SFRP2有负调节作用，并在分子水平验证了miR-106a-5p与SFRP2 mRNA-3′UTR的靶结合位点。

本研究使用手术诱导的股骨头缺损模型模拟骨再生过程。虽然该模型与Perthes病修复期共享病理特征，但并未完全重现临床Perthes病的多因素病因（如血管功能不全）。需要在疾病特异性模型中进一步验证。

结论

总之，我们的研究结果表明miR-106a-5p/SFRP2轴激活增强股骨头缺损中的成骨和骨再生。虽然需要进一步研究验证其在临床Perthes病中的作用，但该机制可能代表具有类似病理生理条件（包括Perthes病再生期）骨修复的治疗靶点。需要进一步研究探索SFRP2的确切作用机制以及miR-106a-5p/SFRP2用于缺损股骨头修复的临床应用。