利用十二指肠RNA测序与实时PCR生物标志物进行儿童乳糜泻分子分型及早期诊断研究

　　本研究通过RNA测序和实时PCR技术，首次系统揭示了儿童乳糜泻（CD）患者十二指肠黏膜基因表达谱与组织转谷氨酰胺酶抗体（anti-TG2）水平的动态关联，发现14个核心基因标志物可精准区分活动期CD与非CD状态（特异性100%），为血清学阴性/组织学不典型CD的诊断提供了分子分型新策略。

　　

研究背景与方法创新

乳糜泻（Celiac Disease, CD）是一种由麸质摄入引发的自身免疫性肠病，其诊断依赖小肠活检的组织学评估（Marsh分级）。尽管组织转谷氨酰胺酶抗体（anti-TG2）检测已成为重要筛查手段，但约50%疑似患儿因anti-TG2水平低于10倍正常值上限（<10×ULN）仍需活检确诊，且部分患者存在组织学不典型（Marsh 0-1）或抗体阴性情况，导致诊断延迟。本研究创新性地联合RNA测序（RNA-seq）和实时PCR技术，对36例儿童十二指肠活检样本进行多组学分析，涵盖非CD对照组、规范化治疗CD组、潜在CD（含进展/非进展亚型）及典型活动期CD组（依据anti-TG2水平进一步分为活检诊断组和血清学诊断组），旨在探索基因表达与anti-TG2水平的关系，建立CD分子诊断标志物谱。

核心发现：基因表达谱与anti-TG2水平的关联

RNA-seq分析显示，活动期CD（Marsh 3）患者十二指肠黏膜存在1210个差异表达基因（DEGs）。其中anti-TG2高水平组（>10×ULN）相较于低水平组（1-10×ULN），虽组织学损伤程度相似，但基因表达谱显著不同：

1. 1.

   免疫应答相关基因（如B细胞激活、免疫球蛋白产生、吞噬作用）在高水平组表达更强；
   

2. 2.

   细胞周期进程基因（如^MAD2L1、^E2F5）在高水平组显著上调，提示上皮细胞过度增殖；
   

3. 3.

   脂代谢与脂蛋白相关基因（如^APOA1、^APOC3）及视黄醇代谢基因表达下调，可能与肠吸收功能障碍和维生素A代谢异常相关；
   

4. 4.

   血管生成（如VEGF通路）和上皮屏障功能基因（如^OCLN）表达受损，印证CD的微血管改变和肠通透性增加。

潜在CD的分子特征与异质性

潜在CD组（Marsh 0-1）表现出高度异质性：

• •

  无进展组基因表达接近非CD对照组，仅^TRDV1（γδ T细胞受体基因）等少数基因表达升高；
  

• •

  进展组（5年内发展为典型CD）则呈现部分活动期CD特征，如免疫激活（^IFNG、^CXCL11）和上皮屏障功能基因下调，但个体差异显著。这种异质性可能与黏膜病变的局灶性分布或疾病早期动态变化有关。

14基因诊断模型的构建与验证

通过机器学习筛选出14个核心标志基因：^CXCL11、^CYP3A4、^DDX60、^E2F5、^HCP5、^IFI27、^IFNG、^IL17A、^MAD2L1、^MMP12、^NLRC5、^OXCT1、^PSMB9和^SAMD9L，涵盖免疫应答、细胞增殖、代谢调节等多通路。实时PCR验证显示：

• •

  对活动期CD的诊断特异性达100%，敏感性93%（误诊案例与黏膜斑片状病变或采样技术有关）；
  

• •

  在潜在CD组中，无进展病例均被正确归类为非CD，但进展组敏感性降至77%，反映其分子表型的不稳定性。

生物学意义与临床价值

1. 1.

   ^TRDV1表达升高见于所有Marsh 1及以上病变，提示γδ T细胞浸润可能是CD早期免疫标志；
   

2. 2.

   ^CYP3A4（绒毛尖端表达）和^MAD2L1（隐窝增殖标志）分别反映绒毛萎缩和隐窝增生程度；
   

3. 3.

   视黄醇代谢紊乱与CD患者的维生素A缺乏风险直接相关；
   

4. 4.

   模型可辅助鉴别血清阴性CD（如3例Marsh 3但anti-TG2阴性患者均被正确归类）。

局限与展望

本研究样本量较小（尤其潜在CD组），且活检与RNA分析非同一组织块，可能引入偏差。未来需扩大样本验证基因谱的预后价值，并探索无创检测应用。

结论

十二指肠基因表达谱可精准区分CD与非CD状态，且与anti-TG2水平动态相关，为组织学不明确或血清学阴性CD提供了互补诊断工具，但其对疾病进展的预测能力有限，更适用于现症诊断而非预后评估。