综述：用于蛋白质位点选择性非酶共价修饰的肽标签

　　本综述系统评述了利用肽标签实现蛋白质位点选择性共价修饰的前沿策略，重点介绍了基于金属离子络合、小分子-标签相互作用及肽-肽识别的多种技术体系（如His标签、π-clamp、四半胱氨酸标签等），涵盖了其在抗体药物偶联物（ADC）、荧光成像和蛋白功能研究中的应用，为精准生物偶联提供了重要工具。

　　

1 引言

蛋白质偶联技术对于研究蛋白质动力学、开发药物制剂及工业生物催化剂至关重要。理想的方法需在温和条件下实现高产量、均质且稳定的位点选择性修饰。传统方法通常靶向赖氨酸（Lys）、N端胺或半胱氨酸（Cys）等天然亲核残基，但缺乏位点选择性，可能导致产物异质性和功能受损。例如，FDA批准的抗体药物偶联物（ADC）中，通过修饰天然Lys或Cys残基产生的批次间差异可能影响疗效和副作用。因此，开发位点选择性反应成为解决这些问题的关键。

2 肽-金属离子络合定向修饰

FLAG标签（DYKDDDDK）和聚天冬氨酸标签（(DDDD)_n）通过螯合金属离子（如Zn(II)、Ni(II)）实现蛋白质标记。Hamachi团队利用Zn(II)-2,2′-二吡啶胺复合物与Asp侧链羧酸的稳定非共价相互作用，开发了CA₆D₄标签（CAAAAAADDDD），用于增强绿色荧光蛋白（eGFP）的Cys标记。尽管Ni(II)与聚Asp标签的亲和力更高，但Zn(II)因无荧光猝灭更适用于分子成像。

组氨酸标签（如HHHHHH）广泛用于蛋白质纯化（IMAC），其与Ni(II)-NTA的络合启发了共价标记策略。Meredith等人首次通过光反应交联剂实现了His标签蛋白质的共价修饰。Hamachi团队进一步开发了Cys-His标签（CH₆），搭配Ni(II)-NTA α-氯乙酰胺探针，实现了eGFP的高选择性标记。为提高细胞应用中的特异性，他们设计了H₅CH₅标签，并使用α-氯乙酰胺或巴豆酰胺探针，成功标记了细胞表面的B2R受体。

此外，组氨酸的咪唑环可催化酰基转移反应。Liu和Melman利用Baylis-Hillman反应性酯与NTA-Zn(II)/Ni(II)/Cu(II)复合，修饰了H₆标签的蛋白质A。Hamachi实验室使用H₁₀标签与对甲苯磺酰基香豆素衍生物反应，实现了eGFP的烷基化。Ohata等人利用Chan-Lam偶联，通过芳基硼酸与天然组氨酸残基反应，实现了蛋白质主干修饰。Ball团队开发的N端焦谷氨酰-组氨酸（Glp-His）二肽标签，在Cu(II)存在下实现了GFP的N-乙烯基化。Guo等人开发的CAST标签（FFKKDDHAA）通过styrylboronic酸探针实现了多种蛋白质的N-烯基化。

3 小分子-标签相互作用导向的修饰

Rozinov和Nolan通过噬菌体展示发现了与TexasRed结合的肽序列TR512（RWTWEPISE），其解离常数（K_D）达pM级。Sunbul等人在此基础上设计了ReacTR标签，通过N-α-氯乙酰胺-TexasRed实现共价标记。

Pentelute实验室通过Split-pool肽库筛选发现了π-clamp序列（FCPF），可与全氟芳香化合物发生亲核芳香取代（S_NAr）反应。他们将此序列应用于曲妥珠单抗重链C端，制备了生物素偶联物和ADC（单甲基奥瑞他汀F，MMAF），并保持了HER2结合活性。Evans等人通过mRNA展示发现了具有更快反应动力学的α-螺旋肽序列。

SPAAC（应变促进叠氮-炔环加成）反应中，DBCO与硫醇的侧反应被转化为“点击”反应。Zhang等人通过筛选发现了Cys标签（LCYPWVY），用于eGFP和曲妥珠单抗的生物素化。

4 肽-肽识别

卷曲螺旋肽（如E3/K3线圈）通过形成超螺旋实现分子识别。Ball团队在K3线圈中引入Glu残基，在E3线圈中引入芳香氨基酸，通过dirhodium催化剂催化重氮试剂烷基化。Wang等人设计了CCE/CCK肽对，通过半胱氨酸或α-氯乙酰基交叉连接，增强了结合亲和力。Yano等人使用R3CL肽探针与ER3标签的Lys残基交联。Reinhardt团队通过N端硫酯与Cys的酰基转移，实现了GPCRs的快速标记。

Tsutsumi等人基于GCN4转录因子的卷曲螺旋三聚体设计了ZIP标签（47氨基酸），通过疏水环境触发NBD荧光。Tamamura团队在ZIP标签环区插入Cys，与N端α-氯乙酰基探针共价交联，并应用了细胞穿透八精氨酸标签。

5 仅由肽标签导向的修饰

Griffin等人开发的四半胱氨酸标签（WEAAAREACCRECCARA）与生物砷荧光染料（FlAsH-EDT₂）结合，实现了蛋白质选择性标记。Tsien团队优化了序列（WDCCGPCCK），提高了亲和力（K_D达pM级），并推出了Resorufin衍生物（ReAsH-EDT₂）。Cao等人设计了Cy3TAG（CCKAEAACC）与AsCy3-EDT₂配对。尽管砷试剂存在细胞毒性，该技术仍广泛应用于蛋白质翻译监测、受体构象变化研究和淀粉样纤维形成检测。

Keillor等人使用二马来酰亚胺荧光团标记二Cys肽标签（如dC10α：LSAAECAAREAACREAAARAGGK），通过降低马来酰亚胺反应性减少了与谷胱甘肽的副反应。Lee等人设计了RC标签（EAAAREARCRERCARA），搭配BODIPY-二丙烯酸酯探针，反应后荧光从橙色变为绿色，可直接观察。

Schepartz团队利用硼酸与多元醇形成硼酸酯的特性，开发了四丝氨酸标签（SSPGSS）和RhoBo探针（罗丹明衍生的双硼酸），实现了细胞质标记，但无法选择性标记细胞表面。

Tanaka等人通过噬菌体展示发现了含三个Lys N^ε-胺的21-mer肽标签，与1,3-二酮形成烯胺酮加合物。Eldridge和Weiss发现了HyRe标签（HKSNHSSKNRE），通过pH调节实现His或Ser的选择性酰肼置换。Kawakami等人通过DIVERSE系统筛选出pClBz反应性肽序列（CRP1和CRP2），实现了DHFR和GFP的标记。

Ramil等人利用2-氰基苯并噻唑（CBT）与N端Cys或内部1,2-氨基硫醇缩合，设计了CX10R7标签（VTNQECCSIPM），用于sfGFP和OmpX的生物素化。Bertozzi团队设计了11-mer肽标签（GGHPDPCPKGG），实现Cys-to-Lys的功能转移。

Brocchini实验室使用PEG-双砜与His咪唑环双烷基化，修饰了H₆标签的干扰素α-2a（IFN）。Geoghegan等人意外发现His标签与葡萄糖内酯（GDL）发生N-葡萄糖酰化，受此启发，Jensen团队开发了Gly-His标签（GHHHHHH），用4-甲氧基苯酯实现稳定N-酰化。Brune等人使用叠氮-GDL，需大量过量，但通过硼酸陷阱减少可逆性。Kofoed等人开发了Lys-His标签（H_nLH_m），用于C端和环区修饰，成功应用于利妥昔单抗的重链标记。

6 结论

短肽标签介导的位点选择性蛋白质修饰技术在基础研究和应用科学中具有重要意义。当前方法依赖于分子识别、肽标签内二级结构的引入以及亲核和酸/碱催化反应。尽管实现与酶基识别相当的选择性仍具挑战，但通过高通量肽库筛选和理性设计，如Gly/Lys-His标签酰化、π-clamp和卷曲螺旋识别等技术正不断进步。对这些生物偶联标签的机理和结构理解将推动进一步优化，为精准生物偶联提供强大工具。