离子交换色谱-质谱联用技术(IEC-MS)在完整蛋白质和蛋白质变体表征中的进展与应用

　　本综述系统总结了离子交换色谱-质谱联用技术(IEC-MS)在完整蛋白质分析中的最新进展，重点介绍了基于pH梯度的分离策略（色谱聚焦、线性pH梯度洗脱和盐介导pH梯度洗脱），详细阐述了挥发性缓冲体系选择、色谱柱特性优化和pH梯度设计对分离效率的关键影响，并探讨了提高IEC-MS灵敏度与电离效率的创新方法。该技术为生物制药（如单克隆抗体mAbs、抗体-药物偶联物ADCs）和复杂生物样品中蛋白质变体（包括翻译后修饰PTMs如脱酰胺、磷酸化、唾液酸化等）的表征提供了强大工具，对推动精准医学和生物药物开发具有重要意义。

　　

IEC方法原理

蛋白质是两性分子，其净电荷取决于周围环境的pH值。等电点(pI)是蛋白质不带净电荷时的pH值，高于pI时带负电，低于pI时带正电。离子交换色谱(IEC)利用蛋白质与固定相之间的电荷差异进行分离，主要分为阴离子交换(AEX)和阳离子交换(CEX)两种模式，又可进一步分为弱离子交换(WAX/WCX)和强离子交换(SAX/SCX)。

蛋白质在IEC中的保留通常采用"开关"机制，在梯度洗脱条件下，主要通过两种策略实现：(1)恒定pH下的盐梯度洗脱，通过改变离子强度破坏静电相互作用；(2)pH变化洗脱，利用pH梯度使蛋白质在接近其pI时洗脱。pH梯度方法包括色谱聚焦（内部pH梯度）和外部pH梯度，其中盐介导pH梯度方法结合了盐和pH梯度洗脱，为复杂样品提供了额外的洗脱控制。

影响蛋白质在IEC中洗脱的因素复杂多样，不仅包括电荷不对称性、离子强度、置换盐类型、表面pH效应和排斥电荷效应等静电因素，还涉及空间效应、范德华力和疏水相互作用等非静电因素。多种数学模型（如立体质量作用模型SMA、Donnan离子交换模型DIX、线性梯度洗脱模型LGE等）被开发用于解释和预测蛋白质的保留行为。

IEC-MS方法的最新趋势

挥发性缓冲体系与pH线性控制

直接IEC-MS方法依赖于挥发性缓冲组分（如乙酸铵AmAc）的使用，以实现IEC分离的同时保持MS兼容性。与IEC-UV中可使用多种非挥发性盐不同，IEC-MS仅有限数量的挥发性添加剂可用：氨水、乙酸AA、甲酸FA、碳酸铵AmCa、碳酸氢铵AmBc、乙酸铵AmAc、甲酸铵AmFo等。

实现挥发性添加剂的线性pH响应仍是IEC-MS分析的关键挑战。为解决这一问题，三种主要策略被探索：(1)引入新型挥发性添加剂扩展缓冲范围，如2,2-二氟乙胺(DFEA)和2,2,2-三氟乙胺(TFEA)；(2)通过编程HPLC泵梯度校正非线性pH曲线；(3)实施盐辅助洗脱，从而缩小需要线性pH变化的pH梯度窗口。

固定相与色谱柱选择

聚合物功能化离子交换剂是IEC中最常用的材料，具有高pH稳定性、高电荷密度和快速传质速率等特点。目前最广泛使用的聚合物是苯乙烯或乙烯基苯乙烯(EVB)与二乙烯基苯(DVB)的共聚物，以及聚(乙烯醇)和聚(甲基丙烯酸酯)。

在固定相形态方面，非多孔IEC固定相通常用于蛋白质分析，其高电荷密度允许增加结合容量和样品负载量，同时固定相形态减少了传质驱动的谱带展宽。3、5和10μm粒径的固定相经常用于市售IEC色谱柱中。

在色谱柱规格方面，宽孔径IEC柱(4-4.6mm内径)通常用于常规分离，而窄孔径柱(2或2.1mm内径)可能更适合MS耦合，因为它们允许使用较低的流速(0.1-0.6mL/min)，便于ESI耦合。

IEC与MS联用方法

IEC与MS的联用可分为间接和直接两种方法。间接耦合策略通常通过离线分馏后重新进样到另一个MS兼容的LC分离或使用膜旋转过滤器脱盐后进行静态纳米喷雾灌注来实现，也可利用二维LC(2DLC)在线进行IEC缓冲液交换。

直接IEC-MS方法近年来得到迅速发展，主要通过以下策略促进直接耦合：(1)在分离期间或分离后添加有机改性剂（如乙腈ACN），增强ESI-MS中的电离；(2)降低进入MS的流速，通过微流LC(1-100μL/min)和柱后分流实现，提高脱溶效率和提高灵敏度；(3)使用多喷嘴ESI电离，将洗脱液流分成多个电喷雾发射器，实现更有效的去溶和电离；(4)直接开发纳流IEC-MS方法，使用毛细管柱和挥发性盐介导的pH梯度。

IEC-MS在电荷变体分析中的应用

生物药物分析

生物药物已成为治疗复杂疾病的关键治疗剂，其中重组单克隆抗体(mAbs)因其高特异性、功效和延长半衰期而成为最突出的产品之一。mAbs具有异质性，以各种蛋白质形式存在（如糖基化等PTMs）。在产品开发和质量控制期间，IEC作为评估完整蛋白质水平PTMs的关键分析工具。

SCX-based方法通常用于mAb-based治疗药物的分析，但Liu等证明AEX-MS(SAX)也可用于分离IgG4的电荷变体，对IgG4 Fc区域中的多个属性显示出优异的分辨能力，并与SCX方法具有互补选择性。

其他治疗药物也通过IEC-MS方法进行了研究，包括：(1)抗体-药物偶联物(ADC)，由mAb通过共价化学连接与小分子药物连接组成；(2)共配制抗体(CFAs)，将两种或更多种抗体组合在单一剂型中；(3)双特异性抗体(BsAbs)，结合两种不同抗体的特性以靶向两个 distinct抗原；(4)单域抗体(sdAbs)，是最小的抗原结合域（约15kDa）；(5)PEG化蛋白质，可有效增强蛋白质治疗药物的药代动力学和药效学。

病毒和疫苗分析

腺相关病毒(AAVs)是无包膜、单链DNA病毒，能够以低免疫毒性风险在体内转导多种物种。AAV衣壳由三种类型的病毒蛋白(VPs)组成，分子量为兆道尔顿，根据血清型具有不同的VP组成和PTMs。Wu等利用SAX-RPLC-MS平台分离AAV样品中的空壳和完整壳，并表征VPs的特定PTMs。

诺如病毒是无包膜、正链RNA病毒，对公共卫生构成巨大威胁。Creutznacher等发现位于P结构域蛋白中的Asn373存在不可逆脱酰胺化，导致每个单体带负电荷。他们使用IEC和离线天然MS研究基于修饰Asn373和点突变Asn373Gln之间电荷差异的单体交换动力学。

Wu等采用SCX-MS和成像毛细管等电聚焦(icIEF)鉴定SARS-CoV-2重组疫苗在完整水平上的电荷变体，并整合其他技术对其异质性进行深入分析。

内源性蛋白质形式分析

PTMs（如糖基化）通常影响蛋白质的稳定性、活性和功能。研究这些天然PTM形式可以更深入地了解结构与功能之间的关系。Füssl等使用基于pH梯度的SAX-MS方法分析血清白蛋白、人转铁蛋白和天然人α-1-酸性糖蛋白(AGP)。随后的研究发现，与健康个体相比，患者中的岩藻糖基化和聚糖占据率迅速增加。

高密度脂蛋白(HDLs)也通过IEC-MS进行分析。这些蛋白质的水平被认为与冠心病有强烈的负相关关系。Hsieh等使用AEX和MALDI-MS表征来自六名健康捐赠者的具有增加电荷的HDLs，并评估其组成和生物活性。

除了靶向蛋白质形式研究外，使用单一方法分离复杂样品中的蛋白质形式提出了重大挑战。Fischer等开发了在线混合床离子交换柱，能够在非变性条件下同时分离复杂混合物中的酸性和碱性内源性蛋白质，保留非共价相互作用用于天然自上而下蛋白质组学分析。Zhai等开发了一种高灵敏度的纳流SCX-nMS方法，用于直接分析大肠杆菌细胞裂解物。

食品蛋白质分析

IEC-MS通过识别食品中存在的特定蛋白质及其相应同工型，在食品工业中发挥关键作用，从而有助于提高食品质量和安全（例如研究过敏与存在的蛋白质形式之间的潜在联系）。

骨桥蛋白(OPN)是一种酸性且高度磷酸化的糖蛋白，参与各种生理功能，由于其能够模拟母乳并促进婴儿肠道健康和大脑发育，是婴儿配方奶粉中的潜在候选成分。OPN是一种酸性蛋白质，因此AEX方法适合其表征。

卵白蛋白是另一个例子。该蛋白质因其高营养价值和优异功能特性而广泛用于食品工业。它也是一种主要的人类过敏原，其过敏原性与糖基化(N292)和磷酸化(S68和S344)有关。Yang等利用SAX-MS评估天然卵白蛋白的结构异质性。他们发现与乙酰化、磷酸化、氧化和琥珀酰亚胺修饰相关的蛋白质形式降低了其免疫球蛋白G(IgG)/免疫球蛋白E(IgE)结合能力，而唾液酸化有利于这种结合能力。Füssl等开发了基于pH梯度的SAX-MS方法，在天然条件下在完整蛋白质水平上表征卵白蛋白质形式，识别了150多种不同的蛋白质形式，包括片段和二聚体。

总结与展望

pH梯度-based IEC-MS技术为从完整水平表征多种蛋白质及其变体提供了强大工具。与盐梯度方法相比，pH梯度和盐介导pH梯度方法提供了使用挥发性添加剂（如AmAc）实现IEC与MS直接耦合的简单途径。IEC-MS也被认为是一种天然色谱模式，为保护高级结构、分子完整性和蛋白质原始组成提供了机会。

新技术最近被引入以解决IEC-MS中的一些挑战。例如，开发了三种方法（新型挥发性盐、非线性pH曲线校正和线性pH响应区中盐辅助快速洗脱）来解决由于挥发性盐选择有限导致的分析物共洗脱问题。采用有机改性剂、多喷嘴ESI、掺杂剂富集氮气和纳流IEC-MS来增强电离和提高灵敏度。尽管一些技术仍在开发和改进中，但它们为IEC-MS指明了一些有前景的方向，并有望为完整蛋白质形式分析奠定坚实基础，为生物制药分析、天然自上而下蛋白质组学、临床研究和其他样品有限的应用开辟新机遇。