靶向HPV16/18 E7的双特异性Affitoxin：在宫颈癌治疗中展现卓越抗肿瘤活性及EMT逆转能力

　　本研究针对高危型HPV16/18感染所致宫颈癌缺乏特异性靶向治疗药物的临床难题，创新性地构建了同时靶向HPV16/18 E7蛋白的双特异性affitoxin（Z16-GrB-Z18和Z16-18-GrB）。研究证实该affitoxin能特异性诱导癌细胞凋亡，通过激活caspase-8/3通路显著抑制肿瘤生长，并逆转上皮间质转化（EMT）进程。体内实验显示其具有优异的肿瘤靶向性和安全性，为HPV驱动型宫颈癌的精准治疗提供了新策略。

　　

宫颈癌作为严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其发病机制与高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染密切相关。在众多HPV亚型中，HPV16和18型尤为特殊，它们共同导致了近75%的宫颈癌病例。然而令人遗憾的是，尽管HPV疫苗在预防感染方面取得显著成效，但对于已经形成的HPV感染及相关病变，临床仍缺乏能够特异性清除HPV感染的治疗手段。当前标准治疗方案包括手术切除、放射治疗以及以顺铂为基础的化疗，这些方法虽然具有一定疗效，但往往伴随着严重的毒副作用和耐药性问题。

更为棘手的是，宫颈癌的转移和复发一直是临床治疗中的难点。研究表明，上皮间质转化（EMT）过程在这一现象中扮演着关键角色——HPV16 E7癌蛋白能够诱导宫颈癌细胞发生EMT，从而增强其侵袭和转移能力。因此，开发一种能够同时靶向HPV致癌蛋白并逆转EMT过程的治疗策略，具有重要的临床意义。

在这一研究背景下，温开荣等研究人员在《Journal of Translational Medicine》上发表了一项创新性研究，他们成功构建了一种新型双特异性affitoxin，能够同时靶向HPV16和HPV18型的E7癌蛋白。这种分子巧妙地将affibody的靶向性与颗粒酶B（GrB）的细胞毒性相结合，如同为抗癌治疗装上了"精确制导系统"，实现了对HPV阳性宫颈癌细胞的精准打击。

研究人员采用多种关键技术方法开展本研究：通过表面等离子共振（SPR）技术验证双特异性affitoxin与靶标蛋白的结合特性；利用共聚焦免疫荧光法检测其在细胞内的定位；采用CCK-8法和CellTiter-Lumi发光法评估细胞活力；通过TUNEL法检测细胞凋亡；使用伤口愈合和transwell实验分析细胞迁移能力；建立裸鼠移植瘤模型进行体内抗肿瘤效果评价；并通过血液学检测、生化分析和组织切片评估急性毒性。

制备具有双靶向亲和力的双特异性affitoxin

研究人员设计了三种不同组合方式的双特异性affitoxin分子，但只有Z₁₆-GrB-Z₁₈和Z_16-18-GrB两种形式在大肠杆菌表达系统中成功表达并纯化。SPR分析显示，这两种affitoxin均能有效结合HPV16E7和HPV18E7蛋白，其中Z₁₆-GrB-Z₁₈对HPV16E7的结合亲和力最强（KD=1.97 nM）。

双特异性affitoxin与HPV16和18阳性CC细胞的结合

共聚焦免疫荧光结果显示，Z₁₆-GrB-Z₁₈和Z_16-18-GrB能够特异性进入HPV16阳性的SiHa细胞和HPV18阳性的HeLa细胞，并与细胞内的E7蛋白共定位，而在HPV阴性的C33A细胞中则未观察到明显结合。

双特异性affitoxin对HPV16和18阳性CC细胞的抑制作用

细胞毒性实验表明，两种双特异性affitoxin对SiHa和HeLa细胞均表现出显著的生长抑制效果，其IC₅₀值在1.937-2.191μM之间，明显优于单纯的双特异性affibody（Z_16-18）的抑制效果。

双特异性affitoxin诱导HPV16和18阳性CC细胞凋亡

TUNEL检测结果显示，Z₁₆-GrB-Z₁₈和Z_16-18-GrB处理组在SiHa和HeLa细胞中诱导的凋亡率显著高于对照组。Western blot分析进一步证实，affitoxin处理能够激活caspase-8和caspase-3的剪切形式，表明其通过caspase途径诱导细胞凋亡。

双特异性affitoxin抑制HPV16和18阳性CC细胞的迁移

伤口愈合和transwell实验结果表明，双特异性affitoxin和affibody均能显著抑制SiHa和HeLa细胞的迁移能力。Western blot分析发现，经处理的细胞中上皮标志物E-cadherin表达增加，而间质标志物Vimentin和转录因子Snail表达下降，表明这些分子能够逆转EMT过程。

双特异性affitoxin在体内向肿瘤组织的蓄积

近红外荧光成像显示，静脉注射后4小时，Z_16-18-GrB-DyLight-755和Z_16-18-DyLight-755在荷瘤小鼠的肿瘤部位呈现明显的红色荧光信号，而非靶向的Z_WT-GrB-DyLight-755组则未观察到类似现象，证明双特异性affitoxin具有优异的体内靶向性。

双特异性affitoxin在体内抑制肿瘤进展

动物实验表明，Z_16-18-GrB处理组对SiHa和HeLa移植瘤的生长抑制效果显著优于单纯的Z_16-18处理组，表现为肿瘤体积更小、重量更轻。值得注意的是，affitoxin处理组小鼠体重保持稳定，而顺铂组小鼠体重下降，表明affitoxin具有更好的安全性。

双特异性affitoxin不产生急性毒性

急性毒性评价显示，Z_16-18-GrB处理组小鼠的血常规指标、肝肾功能参数均与对照组无显著差异，肝肾脏器组织切片也未发现明显病理改变，证明该双特异性affitoxin在实验剂量下具有良好的安全性。

双特异性affitoxin的药代动力学和稳定性研究

药代动力学研究表明，双特异性affitoxin在兔体内分布迅速，4小时后血药浓度显著降低，推测其可能富集于靶组织或被肾脏代谢。体外稳定性实验显示，affitoxin在兔血浆中孵育72小时后仍保持较高稳定性，表明其对血浆蛋白酶具有良好的抵抗能力。

本研究开发的靶向HPV16/18 E7的双特异性affitoxin代表了一种创新的肿瘤靶向治疗策略。与传统抗体药物相比，affibody分子具有分子量小、穿透性强、免疫原性低等优势，且能够通过dynamin和caveolin-1依赖的内吞途径进入细胞，解决了单克隆抗体细胞内递送的瓶颈问题。而选择人源的颗粒酶B作为效应分子，则避免了异源毒素可能引起的免疫原性问题。

研究结果表明，这种双特异性affitoxin不仅能够特异性靶向HPV阳性宫颈癌细胞，诱导其凋亡，还能逆转EMT过程，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。动物实验进一步证实了其优异的肿瘤靶向能力和抗肿瘤效果，同时具有良好的安全性和药代动力学特性。

该研究的成功为HPV驱动型宫颈癌的精准治疗提供了新思路，特别是针对目前临床治疗中面临的转移和复发难题提供了潜在解决方案。这种双功能分子设计策略也可能为其他病毒相关肿瘤的治疗提供借鉴，具有重要的临床转化价值和广阔的应用前景。