高亲和力与蛋白酶稳定性荧光肽类NTS1R配体的开发及其在肿瘤成像中的应用

　　本研究针对神经降压素受体1（NTS1R）在肿瘤诊断与机制研究中对高亲和力、高稳定性荧光探针的迫切需求，通过理性设计将TMSAla13替换、Nα-甲基化及β,β-dimethyl-Tyr11引入等策略整合，开发出新型荧光标记配体19（5-TAMRA标记）和21（sulfo-Cy5标记）。两者均表现出亚纳摩尔级亲和力（Ki分别为0.14 nM和0.094 nM）和远超48小时的血浆稳定性，成功应用于流式细胞术、共聚焦显微镜及肿瘤组织分子成像，为NTS1R相关研究提供了强大工具。

　　

在生物医学研究领域，神经降压素受体1（neurotensin receptor 1, NTS₁R）作为G蛋白偶联受体（GPCR）家族的重要成员，因其在中枢神经系统、胃肠道以及多种恶性肿瘤中的特异性表达而备受关注。尤其是在胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和部分乳腺癌中，NTS₁R的过度表达使其成为肿瘤诊断和靶向治疗的一个极具潜力的分子靶点。然而，尽管放射性标记的NTS₁R配体在肿瘤显像中已显示出应用前景，但它们面临着放射性安全风险、废物处理难题以及使用限制较多等问题。相比之下，荧光标记的配体具有安全性高、操作简便、兼容多种检测技术（如流式细胞术、高内涵成像、荧光各向异性等）等优势，能够实时动态地研究受体-配体相互作用，因此在基础研究和临床前研究中具有不可替代的价值。

尽管目前已有一些荧光标记的NTS₁R配体被报道，但它们通常在结合亲和力或蛋白酶稳定性方面存在不足。例如，许多探针源于神经降压素（neurotensin, NT）的C端活性片段NT(8-13)，但其本身极易被血浆中的蛋白酶快速降解，半衰期极短，严重限制了其应用。此外，较低的亲和力可能导致非特异性结合率高，信噪比低，尤其是在受体表达水平较低的病理条件下。因此，开发兼具高亲和力、高蛋白酶稳定性以及优异光学特性的新型荧光NTS₁R配体，成为该领域一个迫切的需求。

为了解决这一挑战，由Fabian J. Ertl和Max Keller等人组成的研究团队在《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一项创新性研究。他们巧妙地融合了多种先前报道的有效策略：首先，用(trimethylsilyl)alanine (TMSAla) 替换C末端的Leu¹³，这一改动可显著提升配体与NTS₁R的结合亲和力；其次，将Arg⁸替换为一个氨基功能化的氨甲酰化精氨酸(Arg(carb))，该位点为后续连接荧光染料提供了一个理想的偶联位点，且之前的研究证明在此处进行修饰对受体结合影响最小；最后，为了克服肽链易被蛋白酶水解的问题，研究团队对N端进行了甲基化（N^α-methylation），并用β,β-二甲基酪氨酸（β,β-dimethyl-Tyr）替换了Tyr¹¹，这两种修饰能分别有效抵抗氨肽酶和羧肽酶的降解。

通过这些精心设计，团队成功合成了一系列NT(8-13)的衍生物肽段，并最终制备了两个分别标记了5-TAMRA（化合物19）和sulfo-Cy5（化合物21）的荧光探针。这两个探针不仅保持了极高的NTS₁R结合亲和力（K_i值分别达到0.14 nM和0.094 nM），更重要的是，它们在人类血浆中展现了卓越的稳定性，半衰期远远超过48小时。此外，它们还作为完全激动剂，能够有效激活NTS₁R下游的钙信号通路。

在研究过程中，团队运用了多项关键技术方法：包括固相肽合成（SPPS）技术构建目标肽链；通过放射配体竞争结合实验（使用[³H]UR-MK300作为放射性配体）在表达NTS₁R的HT-29结肠癌细胞系上精确测定亲和力；利用流式细胞术进行饱和结合、动力学及竞争结合实验，全面评估荧光探针的细胞结合特性；采用共聚焦激光扫描显微镜直观观察探针与受体结合后的内化过程；并使用生物分子成像系统（Azure Sapphire）对活细胞和冻存的人源HT-29肿瘤组织切片进行荧光成像分析，以评估其在实际样本中的应用潜力。

合成与稳定性

研究人员首先合成了包含TMSAla¹³、N^α-甲基化精氨酸和β,β-二甲基酪氨酸的关键前体肽17a。然后，通过其侧链上的氨基分别与5-TAMRA-NHS酯（18）和sulfo-Cy5-NHS酯（20）反应，高效地得到了目标荧光探针19和21。稳定性测试表明，两者在PBS缓冲液中化学性质稳定，更重要的是在人类血浆中孵育48小时后，仍能保持90%以上的完整性，远优于迅速降解的天然NT(8-13)片段。

受体结合特性

通过放射配体竞争结合实验证实，前体肽17a对NTS₁R具有极高的亲和力（K_i = 0.055 nM）。连接上大体积的荧光染料后，探针19和21的亲和力仅有轻微下降，表明通过Arg⁸位点进行标记的策略非常成功。此外，它们对NTS₂R也表现出较高的亲和力（K_i ≈ 0.75 nM），表明它们是双亚型配体。在功能实验中，两者均被证明是NTS₁R的完全激动剂，能有效诱导细胞内钙离子 mobilization（EC₅₀ ≈ 1.2 nM）。

光物理特性

对荧光探针本身的光学性质表征显示，5-TAMRA标记的19和sulfo-Cy5标记的21均具有适合其相应检测通道的激发和发射光谱。值得注意的是，当存在牛血清白蛋白（BSA）时，21的荧光量子产率和寿命有所增加，而19的则略有下降，这提示染料与蛋白质环境的相互作用会影响其光物理行为，这是在应用时需要考虑的因素。

流式细胞术结合研究

利用流式细胞术，研究人员在天然表达NTS₁R的HT-29细胞和过表达该受体的CHO细胞上详细评估了19和21的结合特性。饱和结合实验证实了它们的结合是特异且可饱和的，测得的K_d值与放射配体实验结果高度一致。动力学研究发现，21的结合和解离行为符合单相模型，而19则显示出双相结合的特征，这可能与其诱导受体内化（internalization）的动力学过程有关。两种配体都表现出缓慢的解离速率，尤其是21的解离半衰期很长，这种近乎不可逆的结合特性非常有利于成像应用，尽管对于竞争结合实验可能需要更长的孵育时间。研究还成功利用这些荧光探针进行了竞争结合实验，测定了多种已知NTS₁R配体（如SR142948、SR48692）的抑制常数（K_i），结果与文献值吻合良好，证明了它们作为替代放射配体的工具化合物的可靠性。一个有趣的发现是，荧光探针21与一种名为SBI-553的NTS₁R正构变构调节剂（allosteric modulator）共同使用时，后者能以双相方式增强21与受体的结合，这为了解变构调节机制提供了新的线索。

显微成像与组织应用

共聚焦显微镜成像实验直观地展示了19和21与HT-29细胞及CHO-NTS₁R细胞上受体的特异性结合。图像清晰显示，配体结合后会发生受体介导的内化作用，进入细胞内的囊泡结构中。最后，团队利用生物分子成像系统证明，sulfo-Cy5标记的21能够在体外培养的HT-29细胞和来源于小鼠的HT-29肿瘤组织切片上，清晰地显示出NTS₁R的分布，且信噪比非常高。相比之下，5-TAMRA标记的19由于激发波长较短，受组织自发荧光干扰严重，不太适用于复杂的组织样本成像。

综上所述，本研究成功地开发出了一类具有超高亲和力和卓越蛋白酶稳定性的荧光肽类NTS₁R配体。其中，sulfo-Cy5标记的探针21尤为突出，它不仅结合特性优异，其近红外发射光谱特性更使其能够有效地用于肿瘤组织的荧光成像，避免了自发荧光的干扰。这项工作解决了该领域长期存在的探针稳定性差和亲和力不足的技术瓶颈，所提供的强大分子工具不仅可用于NTS₁R相关的体外结合试验和细胞水平研究，更重要的是为未来在体肿瘤模型的NTS₁R表达可视化、肿瘤边界界定乃至手术导航提供了巨大的转化应用潜力。此外，该研究中所采用的理性设计策略——即组合多种有效的结构修饰方法于单一分子中——也为开发其他肽类GPCR的荧光探针提供了宝贵的范例和思路。