靶向流感病毒血凝素H1和H5的N-[(噻吩-3-基)甲基]苯甲酰胺类融合抑制剂研究

　　本研究针对流感病毒治疗药物需求，报道了一系列靶向血凝素(HA)融合过程的N-[(噻吩-3-基)甲基]苯甲酰胺类化合物。先导化合物VF-57a对A/H1N1病毒EC50达0.8 μM，选择性指数>130，并能有效抑制A/H1N1和A/H5N1假病毒入侵。通过细胞融合实验、表面等离子共振和耐药性研究证实其通过稳定HA蛋白预融合构象发挥作用，分子模拟揭示了二甲基噻吩基团的关键作用，为开发广谱流感抑制剂提供了新策略。

　　

流感病毒至今仍是全球健康的重大威胁，每年导致数十万人死亡，尤其对老年人和有基础疾病的人群危害更大。虽然疫苗接种是主要预防手段，但疫苗有效性仅有30-60%，且病毒变异频繁，使得抗病毒药物成为不可或缺的治疗选择。目前主流药物如奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂和巴洛沙韦等聚合酶抑制剂虽有效，但耐药性问题日益突出，迫切需要针对新靶点的抗病毒药物。

在这种背景下，流感病毒的血凝素(hemagglutinin, HA)蛋白成为备受关注的新靶点。HA是病毒表面的三聚体糖蛋白，在病毒入侵过程中扮演关键角色：首先与宿主细胞表面的唾液酸糖链结合，随后在内涵体酸性环境下发生构象变化，促使病毒膜与细胞膜融合。阻断这一融合过程，就能有效抑制病毒感染。虽然已有阿比多尔(Arbidol)等HA抑制剂上市，但其活性和选择性仍有提升空间。

为此，比利时鲁汶大学Rega研究所Lieve Naesens和Santiago Vázquez团队在《Journal of Medicinal Chemistry》上发表研究，设计合成了一系列N-[(噻吩-3-基)甲基]苯甲酰胺类化合物，并对其抗病毒活性和作用机制进行了深入探索。

研究人员主要运用了以下关键技术：基于结构的设计合成方法系统构建化合物库；细胞病变效应(CPE)减少实验评估抗病毒活性；假病毒入侵试验检测对H1和H5亚型的抑制效果；细胞-细胞融合实验直接验证融合抑制功能；表面等离子共振(SPR)技术分析化合物对HA构象稳定的影响；病毒传代实验筛选耐药突变株；分子动力学(MD)模拟和热力学整合(TI)计算研究结合模式与自由能变化。

结果与讨论

合成与SAR分析

研究人员通过合理的药物设计，将CL385319的苯甲酰胺核心与化合物21的N-[(噻吩-3-基)甲基]氨基单元结合，创建了杂交分子22作为起点。通过系统性的结构修饰，研究了苯环取代基、噻吩环修饰以及连接链变化对活性的影响。研究发现，苯环3位和5位需要同时存在吸电子基团(如氯和三氟甲基)才能保持活性，而噻吩环的2,5-二甲基对活性至关重要。

抑制H1和H5 HA介导的膜融合

优选化合物VF-57a(化合物23)对A/H1N1病毒(PR8和Virg09株)的EC₅₀分别为0.92 μM和0.31 μM，选择性指数>100。在人源Calu-3细胞中也显示出良好活性(EC₅₀=0.84 μM)。更重要的是，VF-57a对A/H1N1和A/H5N1假病毒入侵均有强效抑制(EC₅₀分别为0.30 μM和0.81 μM)，而对照化合物RL-007对H5的活性比H1低127倍。

VF-57a耐药性表征

通过病毒传代实验，研究人员筛选出对VF-57a耐药的病毒株，发现所有筛选出的病毒克隆对VF-57a和RL-007均表现出交叉耐药性(EC₅₀ > 40 μM)。鉴定出的HA突变包括F118₁L、T301₁I、S54₂P等，其中T301₁I和D90₂G突变使HA蛋白更易在酸性条件下发生构象变化，从而逃避融合抑制剂的抑制作用。

分子动力学模拟探索VF-57a在HA茎部的结合位点

通过分子动力学模拟，研究人员深入研究了VF-57a与HA的结合模式。与结合在B位点的(S)-F0045不同，VF-57a不稳定地结合于该位点。相反，模拟结果显示VF-57a稳定结合于A位点(Arbidol结合位点)，其中二甲基噻吩基团深入疏水口袋，酰胺键与V55₂的羰基氧形成氢键，三氟甲基苯基位于口袋入口。这一结合模式解释了为什么VF-57a对H1和H5有效而对H3无效——H3 HA在该区域存在六个氨基酸差异，特别是S54₂R和L101₂A突变不利于结合。

研究结论表明，N-[(噻吩-3-基)甲基]苯甲酰胺类化合物是一类有效的流感病毒融合抑制剂，其代表化合物VF-57a对A/H1N1和A/H5N1病毒均表现出亚微摩尔级别的抑制活性。通过综合运用假病毒入侵实验、细胞融合实验、SPR分析和分子模拟等技术，研究团队证实了这类化合物通过结合HA茎部A位点，稳定HA预融合构象，从而阻断膜融合过程。

这项研究的意义在于：首先，发现了一类具有广谱抗病毒活性的先导化合物，特别是对高致病性H5N1病毒的有效抑制为应对当前禽流感疫情提供了新选择；其次，通过详细的机制研究揭示了化合物的作用模式和耐药机制，为后续优化提供了坚实基础；最后，研究的分子模拟结果不仅解释了实验现象，还为设计选择性更高的抑制剂提供了结构基础。这些发现支持进一步开发这类IAV融合抑制剂，为应对流感大流行威胁提供了新的药物候选。