基于结核分枝杆菌腺苷酸激酶设计靶向革兰氏阴性菌感染的新型肽抗生素DD-S067及其多重抗菌机制研究

　　本研究针对日益严重的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）感染问题，探索了结核分枝杆菌腺苷酸激酶（MtAdk）的脂多糖结合特性，并基于其AMP结合域（Lys44至Asp54）从头设计了11-mer肽抗生素。通过筛选71种肽，发现DD-S067对CRAB具有强效杀菌活性且不易诱导耐药性。其通过破坏细菌外膜与内膜、诱导活性氧（ROS）引发脂质过氧化等多重机制发挥抗菌作用。转录组分析显示DD-S067抑制电子传递链并激活氧化应激反应，显著抑制CRAB毒力。在脓毒症休克小鼠模型中，DD-S067展现出显著保护效果，为研发蛋白质基抗生素提供了新策略。

　　

在抗生素耐药性日益成为全球健康威胁的背景下，革兰氏阴性菌感染特别是碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB）所引起的疾病，治疗难度极大，临床可选药物稀少，死亡率高。现有抗生素研发进程缓慢，且传统化学抗生素易引发细菌耐药性。因此，开发具有新颖抗菌机制、不易诱导耐药的新型抗生素成为当务之急。

在这一背景下，研究人员将目光投向天然宿主防御肽（Host Defense Peptides, HDPs）及其模拟物。这类肽通常具有膜破坏活性，可快速杀菌且不易产生耐药性。本研究创新性地以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的腺苷酸激酶（Adenylate Kinase, MtAdk）为蓝本，该蛋白在之前的研究中被发现具有与脂多糖（LPS）结合的能力，而LPS是革兰氏阴性菌外膜的关键组分。基于这一特性，研究团队假设MtAdk的特定结构域可能用于设计新型抗菌肽。

为此，作者从MtAdk的AMP结合域（Lys⁴⁴至Asp⁵⁴）出发，通过理性设计合成了71条11肽，并从中筛选出最具抗菌潜力的候选肽DD-S067。该肽对CRAB表现出极强的杀菌活性，最小抑菌浓度（MIC）显著低于常规抗生素，且在长期传代实验中未出现明显耐药性。

进一步机制研究表明，DD-S067可通过多重途径杀灭细菌：其一，破坏细菌外膜与细胞质膜，导致胞内容物泄漏；其二，诱导活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）大量生成，引发脂质过氧化反应，加速细菌死亡。通过转录组学（RNA-seq）分析，团队发现DD-S067处理后CRAB的电子传递链（Electron Transport Chain, ETC）受到显著抑制，氧化应激反应通路激活，毒力因子表达下调。这些结果表明，该肽可通过多靶点作用克服传统抗生素的局限性。

最后，在动物模型中，DD-S067在CRAB诱导的脓毒症休克小鼠中表现出强大的保护效果，显著提高了存活率并降低了细菌负荷。该研究不仅为抗CRAB感染提供了新的候选药物，也为基于蛋白质结构理性设计抗菌肽提供了重要范式。

本研究发表于《Journal of Medicinal Chemistry》，是一项结合结构生物学、肽合成与修饰、微生物学、转录组学及体内外药效评价的综合性工作。

主要关键技术方法包括：基于MtAdk蛋白结构的抗菌肽理性设计与合成（共71条肽）、微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）、时间-杀菌曲线分析、耐药性诱导实验（连续传代培养）、膜通透性与去极化试验（使用荧光染料DiSC₃(5)和SYTOX Green）、活性氧（ROS）检测、脂质过氧化水平测定（硫代巴比妥酸反应物法）、转录组测序（RNA-seq）与生物信息学分析、以及CRAB诱导小鼠脓毒症模型的体内药效评价。

研究结果

DD-S067对临床分离CRAB菌株具有强抗菌活性且不易诱导耐药

通过筛选71种设计肽，DD-S067对多种CRAB临床分离株均显示出较低的MIC值（1–4 μg/mL），时间-杀菌曲线证实其快速杀菌特性。连续传代20代后，细菌对DD-S067的耐药性未发生显著改变，表明其具有较高的耐药屏障。

DD-S067通过破坏细菌膜结构发挥杀菌作用

利用SYTOX Green和DiSC₃(5)荧光探针检测发现，DD-S067可迅速增加细菌膜通透性并引起膜去极化，导致胞内ATP泄漏。透射电镜图像进一步显示肽处理后的细菌出现外膜与内膜结构破损。

DD-S067诱导活性氧生成与脂质过氧化

通过H₂DCFDA荧光探针检测，DD-S067处理组ROS水平显著上升。同时，脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量明显增加，且添加抗氧化剂维生素E可部分逆转其杀菌效果，证实氧化损伤在杀菌机制中起关键作用。

转录组分析揭示DD-S067抑制电子传递链并激活氧化应激反应

RNA-seq结果显示，DD-S067处理后CRAB中编码电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的基因显著下调，同时氧化应激相关基因（如katE、sodB等）上调。KEGG通路富集分析表明，肽处理影响了细菌能量代谢和ROS清除系统，最终导致细菌死亡。

DD-S067在体内有效缓解CRAB引起的脓毒症

在小鼠脓毒症模型中，DD-S067治疗组存活率显著高于对照组，肾脏与脾脏细菌负荷明显降低，血清中炎症因子水平下降，组织病理学损伤减轻。

结论与讨论

本研究基于结核分枝杆菌腺苷酸激酶（MtAdk）的脂多糖结合特性，成功设计出一种新型抗菌肽DD-S067，其对CRAB具有强效杀菌作用且不易诱导耐药。该肽通过多重机制发挥作用，包括破坏细菌膜完整性、诱导ROS生成与脂质过氧化、抑制电子传递链功能以及激活氧化应激反应。

特别值得注意的是，DD-S067在动物模型中表现出良好的保护效果，这为其进一步临床开发提供了坚实基础。与传统抗生素相比，DD-S067具有作用机制多样、耐药性低、效果迅速等优势。

该研究不仅为治疗CRAB感染提供了新的候选分子，也为基于天然蛋白结构理性设计抗菌肽开辟了新路径。未来可在此基础上进行肽的优化与剂型开发，推动其向临床应用转化。