基于原代支气管上皮细胞的封闭式肺芯片模型及其在人冠状病毒NL63感染研究中的应用

　　本刊推荐：为克服传统模型在模拟人体呼吸道结构与功能方面的不足，研究人员开发了一种定制化的被动流动高密闭性肺芯片（LoC），用于在气液界面（ALI）培养人原代支气管上皮细胞（hPBECs）。该研究成功模拟了人冠状病毒NL63（HCoV-NL63）的感染与复制过程，证实了干扰素通路相关基因（如ISG15、IFIT1）的上调。此平台为安全、高效地研究呼吸道病毒病理及药物筛选提供了重要工具。

　　

在新冠疫情全球大流行的背景下，呼吸道病毒对公共健康和经济构成的巨大威胁凸显无遗。冠状病毒和流感病毒等病原体引发的疾病，其 preclinical (临床前) 研究却长期受困于缺乏能够精准模拟人体组织结构和功能的模型。传统的 immortalized cell lines (永生化细胞系) 和低通量的动物实验不仅预测疾病机制、药物效果和靶点适用性的准确性有限，许多常用细胞系（如VeroE6）甚至缺乏病毒感染的关键受体，如血管紧张素转换酶2（ACE2）。这严重阻碍了新药研发的进程。因此，开发一种生理相关性高、易于操作且能在高风险病原体环境下安全使用的体外模型，成为呼吸道疾病研究领域的迫切需求。

为了应对这一挑战，一项发表在《Materials Today Bio》上的研究报道了一种创新的解决方案。研究人员成功设计并构建了一种定制化的、被动流动的、高密闭性的芯片（lung-on-chip, LoC），专门用于在气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）条件下大规模培养人原代支气管上皮细胞（human Primary Bronchial Epithelial Cells, hPBECs）。这项研究不仅展示了该平台在安全环境下支持细胞高水平分化和病毒感染研究的能力，还利用人冠状病毒NL63（HCoV-NL63）感染模型，深入揭示了宿主细胞的免疫应答机制，为病毒学研究和新药筛选提供了强有力的工具。

本研究采用了几项关键的技术方法。首先，通过光刻和软光刻技术制造了聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流体芯片，其核心是一个双腔室结构，由水平放置的带孔聚酯（PET）膜隔开，并最终封装于35毫米的标准培养皿中，形成一个完全封闭的系统。其次，研究使用了从患者手术切除的肿瘤游离支气管组织中分离的原代hPBECs进行培养。细胞在芯片上播种后，在重力驱动的摇动灌注下于ALI条件下分化3-4周，形成具有纤毛和分泌细胞的假复层黏膜上皮。最后，感染实验后，利用免疫荧光染色（如KRT5, FOXJ1, MUC5AC, TUBIV, ZO-1, dsRNA）、RT-qPCR（检测病毒拷贝数及ISG基因表达）以及共聚焦显微镜成像等技术对感染效果和细胞应答进行了综合分析。

3.1. Chip manufacturing and characterization

研究人员首先对芯片的制造和特性进行了详细表征。通过激光光学轮廓仪确认模具的微流体结构高度约为800微米，设计包含顶部的肺泡腔（apical chamber）和底部的基底腔（basolateral chamber），由多孔膜分隔。基底腔具有较大的进出口（直径4毫米）可作为培养基储库，而肺泡腔的进出口较小（直径1.2毫米），旨在防止脱水并限制外部颗粒物进入，这对于维持ALI培养至关重要。通过使用红色和蓝色染料进行流体测试，证实了在芯片倾斜时液体可依靠重力实现双向流动，且未发现腔室间染料泄漏。进一步的有限元建模（FEM）模拟了在重力驱动下基底腔内的流速场和压力分布，揭示了流动特性由培养基体积、倾斜角度和摇动频率共同决定。

3.2. On-chip maturation of a bronchial epithelium at ALI

接下来，研究团队成功在芯片上实现了hPBECs的成熟分化。经过测试，一种 pore diameter (孔径) 为0.4 μm、pore density (孔密度) 为6x10⁶ cm^-2的PET膜被确定为支持细胞黏附和分化的最佳材料。细胞播种后，在ALI条件下培养3-4周，形成了连续的上皮细胞层。免疫荧光染色结果证实，分化后的上皮细胞层包含KRT5^POS基底细胞、FOXJ1^POS和TUBIV^POS的纤毛细胞以及MUC5AC^POS和MUC5B^POS的分泌细胞。共聚焦显微镜的三维重建图像清晰显示了细胞顶端的纤毛结构，证明该模型成功模拟了体内气道的黏膜纤毛结构。

3.3. Modelling coronavirus NL63 infection and antiviral treatment in LoC

研究的核心部分是使用该LoC平台模拟HCoV-NL63病毒感染。在ALI分化两周后，将病毒接种于上皮细胞顶面。通过收集顶面洗脱液并进行病毒特异性qPCR检测，发现病毒拷贝数在感染后4-5天内增加，之后开始下降。从细胞裂解液中提取的RNA显示，不同供体间病毒载量存在差异。使用抗病毒药物瑞德西韦（Remdesivir）处理后，显示出了减少病毒复制趋势。免疫荧光染色结果进一步证实了感染的成功：在感染芯片中检测到了病毒复制中间体双链RNA（dsRNA）的信号，而Mock（模拟感染）对照组中则没有；瑞德西韦处理组的感染信号减弱。同时，紧密连接蛋白ZO-1的染色显示，即使在感染后96小时，上皮屏障仍保持完整，未观察到明显的屏障降解。

3.4. Cellular mechanism of response to viral infection by HCoV-NL63 are activated with intrinsic donor variability

最后，研究深入探讨了宿主细胞对病毒感染的免疫应答机制。RT-qPCR分析显示，HCoV-NL63感染显著激活了干扰素刺激基因（ISGs）的表达。特别是，与病毒应答相关的通路（如复制、炎症、免疫调节）均被发现上调。在所有测试的供体中，IFIT1、ISG15和 IRF9等基因表现出较为一致的上调，而 STAT1和 MX1的激活水平则在供体间存在较大变异。这表明，该LoC模型能够成功重现病毒感染所触发的先天免疫应答，同时也突出了个体差异在宿主-病毒相互作用中的重要性。

综上所述，本研究开发了一种新型的、自封闭的、无需外部泵管连接的肺芯片平台。该平台极大地简化了操作流程，显著提升了在生物安全 containment ( containment 指防护或密闭条件，例如BSL-3实验室) 下进行病毒学研究的安全性，使得先进的器官芯片技术能够被任何标准的细胞培养实验室所采用。利用原代hPBECs，研究成功在芯片上复制了具有生理功能的气道黏膜上皮，并证明了其支持HCoV-NL63冠状病毒有效感染和复制的能力。感染引发了预期的病毒复制动力学和宿主细胞强烈的干扰素应答，同时抗病毒药物瑞德西韦也显示了抑制效果。尽管在供体间观察到了一定的应答异质性，但这恰恰反映了真实世界中人体的多样性。该模型为研究呼吸道病毒的致病机制、宿主免疫应答以及筛选新的抗病毒药物提供了一个强大、安全且易于使用的体外平台，具有重要的科学价值和广阔的应用前景。