小分子稳定剂可挽救GPCR中几乎所有错义变体的表面表达

　　本研究针对由蛋白质丰度降低导致的罕见遗传病治疗难题，通过构建AVPR2基因饱和突变文库，结合高通量表面表达筛选技术，发现V2R中超过半数致病错义变体存在表达缺陷。研究证明药物伴侣Tolvaptan能成功挽救87%的不稳定变体，揭示了小分子稳定剂在治疗蛋白稳定性相关遗传病中的广谱应用潜力。

　　

在罕见遗传病研究领域，蛋白质功能缺失往往源于错义变异导致的蛋白稳定性降低和表达量下降。据统计，全球约3亿人受罕见病影响，其中40-60%的致病错义变异通过降低蛋白质丰度引发疾病。尽管计算预测方法取得进展，但精准判定致病变异分子机制仍面临巨大挑战，特别是针对膜蛋白变体的功能解析更为复杂。

血管加压素2受体(V2R)作为G蛋白偶联受体(GPCR)家族成员，其功能缺失会导致肾性尿崩症(NDI)。V2R基因AVPR2位于X染色体，已发现数百个致病变异，其中约半数为错义变异。传统研究仅对少量变异进行实验验证，缺乏系统性评估。本研究通过深度突变扫描技术，全面解析V2R所有可能错义变异的表面表达特征，并探究药物伴侣(pharmacological chaperones, PCs)的广谱拯救效果。

研究人员采用可扩展均匀缺口突变(SU_Ni)技术构建包含V2R所有单氨基酸变异的饱和突变文库，通过PacBio长读长测序将变异与DNA条形码关联。将文库整合到HEK293T着陆垫细胞系后，利用荧光激活细胞分选术(FACS)定量检测各变异体的细胞表面表达水平。实验设置四组表达量分选区间，通过Illumina短读长测序统计各变异在不同区间的分布频率，最终获得6,844个变异的高置信度表达数据。

研究首先发现跨膜区(TM)变异，特别是TM3和TM2螺旋上的变异对表达影响最显著，这些区域的疏水性氨基酸替换会严重破坏蛋白稳定性。与已知临床变异数据集对比显示，gnomAD数据库中的良性变异多保持良好表达，而ClinVar中致病变异和NDI相关变异中超过半数呈现低表达特征。通过AlphaMissense预测，2,911个潜在致病变异中37.7%为低表达型。

温度拯救实验表明，将培养温度从37°C降至27°C能有效恢复多数变异体的表达，证明热力学不稳定性是主要致病机制。更令人振奋的是，V2R特异性拮抗剂Tolvaptan处理能挽救87%的低表达致病变异。通过LOWESS拟合和残差分析，研究发现不能被他法普拯救的变异主要聚集于药物结合位点(如M123^3.36, Y205^×39, V206^5.40等)和功能关键位点(如糖基化位点S5/T6和保守的E/DRY motif)。

研究结果表明，小分子伴侣通过结合蛋白质天然态，提供额外自由能(约-12 kcal mol^-1)来抵消变异引起的稳定性损失。这种拯救效应符合质量作用定律和自由能加和原理，与变异在蛋白结构中的位置无关。未能被拯救的变异恰好揭示了药物的结合位点和蛋白的功能关键区域。

该研究首次在GPCR中系统验证了"通用药物伴侣"概念，为罕见病治疗提供了新范式。研究建立的框架可推广至其他蛋白系统，通过高通量表达筛选快速评估药物伴侣效果，加速广谱治疗药物的开发。论文发表于《Nature Structural & Molecular Biology》，为针对蛋白稳定性疾病的精准治疗开辟了新途径。

研究结论强调，大多数错义变异仅引起微小自由能变化(ΔΔG < 3 kcal mol^-1)，而小分子结合能提供足够补偿能量。这种基于自由能加和的拯救机制具有普适性，只要化合物特异性结合折叠状态，即可实现对整个蛋白结构中变体的广谱拯救。该发现不仅为NDI治疗提供新策略，更为数千种由蛋白稳定性缺陷引发的遗传病治疗带来曙光。