基于转录组学与实验验证揭示6-羟基染料木素通过激活PI3K/AKT信号通路改善高原脑损伤的机制研究

　　本研究通过转录组学分析与实验验证，首次系统阐明天然黄酮类化合物6-羟基染料木素（6-OHG）通过激活PI3K/AKT信号通路，显著改善低压缺氧诱导的脑损伤（HHBI），其作用机制涉及抑制氧化应激（H2O2/MDA↑、SOD/GSH↓）、减轻神经炎症（TNF-α/IL-1β/IL-6↓、IL-10↑）及抑制细胞凋亡（Bax/Bcl-2↓、Caspase-3/9↓），为高原脑损伤的靶向治疗提供新策略。

　　

研究背景

高原地区（海拔>2500米）的低压缺氧（Hypobaric Hypoxia, HH）环境可导致多器官损伤，其中大脑因高耗氧特性对缺氧尤为敏感。低压缺氧诱导的脑损伤（HHBI）以形态结构异常、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应和细胞凋亡为特征，目前缺乏有效防治手段。6-羟基染料木素（6-hydroxygenistein, 6-OHG）作为一种存在于发酵豆制品中的天然异黄酮，既往研究证实其具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等多重生物活性，并能通过激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB/NLRP3通路缓解HHBI，但其深层调控机制尚未完全阐明。

研究方法

本研究整合转录组学分析与实验验证策略。通过RNA-Seq技术对既往研究中脑组织基因表达进行测序，使用DESeq2 R包筛选差异表达基因（DEGs），并利用clusterProfiler进行GO和KEGG功能富集分析。分子对接通过AutoDock Vina软件模拟6-OHG与PI3K/AKT蛋白的结合模式。实验部分采用雄性Balb/c小鼠建立HHBI模型（模拟8000米海拔，0.035 MPa，24小时），通过HE染色观察组织病理变化，商业试剂盒检测氧化应激（H₂O₂、MDA、GSH、SOD）、炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）及凋亡指标（Caspase-3/9活性、Bax/Bcl-2蛋白表达），Western blot检测PI3K/AKT通路关键蛋白磷酸化水平。使用PI3K特异性抑制剂LY294002验证通路依赖性。

转录组学分析结果

RNA-Seq数据显示，对照组（Con）与模型组（Mod）比较发现905个DEGs（239个上调、666个下调），6-OHG治疗组与模型组比较发现192个DEGs（98个上调、94个下调）。GO分析表明DEGs主要富集于信号转导、转录调控、先天免疫反应等生物学过程；KEGG通路分析显著富集到PI3K/AKT、神经活性配体-受体相互作用、Ras及MAPK信号通路。其中PI3K/AKT通路被鉴定为6-OHG调控的核心机制，涉及Igf2、Tnc、Bdnf、Angpt2、Vegfa等关键基因的表达变化。

分子对接与蛋白激活验证

分子对接显示6-OHG与PI3K（PDB: 4JPS）和AKT（PDB: 8UW9）具有高亲和力，结合自由能分别为-8.00 kcal/mol和-9.12 kcal/mol，主要通过氢键、范德华力及Pi-烷基等相互作用稳定结合。Western blot证实HH暴露显著降低脑组织中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值（均^##P <0.01），而6-OHG处理使两者比值分别升高2.09倍和1.70倍（P <0.05, *P <0.01）。LY294002预处理完全逆转6-OHG的激活效应（^&P <0.05, ^&&P <0.01），证实6-OHG的作用依赖于PI3K/AKT通路。

病理与功能学改善效应

HE染色显示HH暴露导致神经元排列紊乱、细胞水肿及血管扩张，6-OHG显著改善病理损伤（P <0.01），而LY294002抵消此保护作用（^&P <0.05）。生化检测表明6-OHG降低H₂O₂（↓39%）和MDA（↓33%），提升SOD活性（↑1.24倍）和GSH含量（↑1.51倍）（P <0.01）；炎症方面，6-OHG降低TNF-α（↓30%）、IL-1β（↓16%）、IL-6（↓21%），升高IL-10（↑1.25倍）（P <0.05, P <0.01）；凋亡指标显示6-OHG抑制Caspase-3（↓27%）、Caspase-9（↓39%）活性及Bax/Bcl-2比值（↓33%）（*P <0.01）。所有改善效应均被LY294002逆转（^&P <0.05, ^&&P <0.01）。

机制讨论

本研究首次通过多组学整合验证揭示6-OHG通过直接激活PI3K/AKT通路发挥神经保护作用。该通路作为调控细胞存活、代谢与凋亡的核心枢纽，其激活可下游调控Nrf2核转位（抗氧化）、抑制NF-κB活化（抗炎）及调节Bcl-2/Bax平衡（抗凋亡）。分子对接提示6-OHG与PI3K/AKT的强结合能力为其靶向干预提供结构基础。抑制剂实验明确证实通路依赖性，且6-OHG对氧化-炎症-凋亡网络的协同调控与PI3K/AKT的多功能特性高度吻合。

研究局限与展望

本研究存在以下局限：样本量较小可能导致核心基因（如PIK3CA、AKT1）mRNA变化未达显著；LY294002可能存在脱靶效应，需基因敲除模型进一步验证；性别单一（雄性小鼠）限制结论普适性；其他富集通路（如MAPK/Ras）可能参与6-OHG效应；全脑分析未能区分区域特异性响应。未来需开展多脑区解析、性别比较及临床前转化研究。

结论

6-OHG通过激活PI3K/AKT信号通路，系统改善HHBI中的氧化应激、神经炎症及细胞凋亡，是一种极具潜力的高原脑损伤治疗候选化合物。研究为靶向PI3K/AKT通路的神经保护策略提供了理论依据和实验支撑。