氧化苦参碱通过KIT/PI3K信号通路抑制肺上皮细胞凋亡缓解急性肺损伤的作用机制研究

　　本研究发现中药活性成分氧化苦参碱（OSC）通过调控KIT/PI3K信号通路，显著抑制脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）模型中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）释放、中性粒细胞浸润及肺上皮细胞凋亡，为OSC作为ALI治疗候选药物提供了实验依据。

　　

Abstract

急性肺损伤（ALI）是一种由多种因素引起的急性弥漫性炎症性肺损伤。氧化苦参碱（OSC）是从传统中药苦参和山豆根中提取的喹啉生物碱，具有抗炎和抗氧化特性，但其对ALI的作用尚不明确。本研究旨在探讨OSC治疗ALI的作用及潜在机制。

Methods

通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平；采用苏木精-伊红（HE）染色观察肺组织变化；通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）法分析肺细胞凋亡；利用流式细胞术检测中性粒细胞聚集；进一步采用网络药理学和分子对接预测作用机制；通过免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、实时定量PCR（RT-qPCR）和Western blotting（WB）等方法验证OSC的关键通路和靶点。

Results

在体内实验中，与LPS诱导的模型小鼠相比，OSC治疗显著抑制弥漫性肺泡损伤和间质水肿，减少中性粒细胞浸润，降低肺上皮细胞凋亡。在体外实验中，OSC预处理增强肺上皮细胞活力，减少LPS诱导的凋亡。网络药理学分析表明，OSC主要靶向PI3K/AKT和凋亡信号通路中的关键蛋白，如KIT、PIK3CA和Bcl-2。分子 docking 证实OSC与这些靶点强结合。PCR、WB、IF和IHC检测进一步表明，OSC预处理提高BEAS-2B肺上皮细胞和肺组织中PI3K、KIT和Bcl-2的表达。

Conclusion

OSC通过调节KIT/PI3K信号通路，减少炎症因子产生、中性粒细胞聚集和肺上皮细胞凋亡。

Introduction

ALI是由严重感染、创伤、休克和烧伤等多种因素引发的全身炎症反应，其特征包括炎症细胞浸润、血管通透性增加以及弥漫性间质和肺泡水肿，导致急性呼吸衰竭。美国ALI发病率为每10万人86.2例，死亡率高达38.5%。ALI常进展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），死亡率达40%。临床治疗ALI通常采用抗炎药物和呼吸支持措施，如皮质类固醇、中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂、他汀类药物和机械通气，但这些方法对降低死亡率效果有限。

ALI的病理特征和机制涉及炎症反应、氧化应激、肺泡-毛细血管屏障破坏、细胞凋亡和组织纤维化。渗出期以免疫细胞介导的肺泡上皮和内皮屏障损伤为特征，导致蛋白-rich水肿和白细胞在间质和肺泡中积聚。活化的巨噬细胞释放炎症细胞因子和凋亡诱导分子，加剧肺损伤。中性粒细胞在肺部大量积聚，释放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症介质。LPS是革兰氏阴性菌的主要成分，常用于建立ALI模型。LPS与LPS结合蛋白（LBP）和CD14受体结合后，呈递给Toll样受体4（TLR4），触发NF-κB活化，启动下游信号传导，并激活PI3K，调节TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症介质的释放。

凋亡是一种选择性的生理性细胞死亡过程，炎症反应是其关键触发因素。TNF-α是最早表达的炎症介质之一，通过调节caspase-9或PIPK3的活化促进细胞凋亡或坏死，也可通过死亡受体途径诱导凋亡。抑制TNF-α产生能显著减少ALI小鼠肺细胞凋亡。IL-1β过量产生吸引更多炎症细胞至病变部位，释放大量促炎介质并引发炎症级联反应。研究证实，IL-1β水平升高抑制正常肺上皮细胞增殖并诱导凋亡。

肺上皮细胞作为抵御外界有害物质的第一道防线，形成气道屏障，抑制病原体、过敏原、致癌物等有害化合物进入肺部，同时防止间质和血管液泄漏，维持气体交换和正常肺功能。多种肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病、过敏性哮喘和ARDS）与气道屏障损伤相关。LPS可诱导肺部中性粒细胞聚集和活化，释放活性氧和弹性蛋白酶，激活免疫细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症介质，触发炎症级联反应，增强caspase-3/9活性，加速肺上皮细胞凋亡，损害肺功能。目前上皮细胞凋亡的通路包括PI3K/Akt通路、Fas/FasL和RIG-I依赖性信号。细胞内凋亡信号通路可通过细胞色素C、凋亡诱导因子和caspases介导的线粒体活化进行调控，并受Bcl-2蛋白家族成员进一步调节。

氧化苦参碱（OSC）是一种从豆科植物苦参和山豆根中提取的喹啉生物碱，具有抗炎、抗凋亡、抗癌、抗心律失常、抗病毒和抗菌等多种药理活性。研究表明，OSC作为一种亲水性弱碱性药物，具有高溶解性和渗透性，主要通过胃肠道被动扩散吸收，口服生物利用度高，适合开发为口服剂型。在传统中医中，苦参和山豆根已被用于治疗溃疡、皮肤烧伤、发热和炎症性疾病数百年。先前研究证明，OSC通过靶向Nrf2/HO-1轴有效抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移。此外，OSC在呼吸道合胞病毒感染的人肺泡II型上皮细胞（A549）中通过干扰NF-κB信号通路显示出显著的抗病毒活性，减少促炎细胞因子和趋化因子的产生。然而，迄今为止尚无关于OSC对ALI作用的全面研究报告。本研究旨在探索OSC对ALI的保护作用及其机制。

Materials and Methods

实验采用6-8周龄雌性C57小鼠，体重（20±2）g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。用LPS（纯度≥98%）诱导小鼠ALI模型。40只小鼠随机分为4组：正常对照组、模型组、低剂量OSC组（20 mg/kg）和高剂量OSC组（40 mg/kg）。OSC组连续7天口服给药，末次给药1小时后鼻腔给予LPS（30 mg/kg）。LPS给药6小时后，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，采集血液、支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织。BALF离心取上清，用于ELISA检测；左肺部分用4%多聚甲醛（PFA）固定，部分保存于-80°C。

肺组织石蜡切片进行HE染色和TUNEL染色；通过肺湿重/干重（W/D）比值评估肺水肿程度；ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6水平；流式细胞术检测BALF中性粒细胞（CD11b和Ly6G标记）和BEAS-2B细胞凋亡（Annexin V/PI双染）。

人肺上皮细胞系BEAS-2B培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。用MTT法检测细胞活力；网络药理学通过BATMAN和Swiss Target Prediction数据库获取OSC相关靶点，从OMIM、Drugbank和GeneCards数据库获取ALI和气道上皮细胞凋亡（AEC）相关靶点，利用Venny图取交集，DAVID平台进行KEGG通路富集分析，STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白互作（PPI）网络并筛选核心靶点；分子对接通过PDB数据库下载靶蛋白3D结构，Autodock Tools软件进行对接；Western blotting检测KIT、p-PI3K、PI3K、Bcl-2和BAX蛋白表达；免疫荧光和免疫组化检测上述蛋白在细胞和组织中的表达；RT-qPCR检测mRNA水平，引物序列见表1。

数据以均值±标准差（SD）表示，采用SPSS 22.0和GraphPad Prism软件进行单因素方差分析（ANOVA）和t检验，P<0.05为差异显著。

Results

OSC改善ALI小鼠病理变化

HE染色显示，正常组小鼠肺组织结构完整，细胞排列整齐，肺泡无渗出；LPS组肺泡塌陷和弥漫性炎症细胞浸润明显；OSC治疗显著减少炎症细胞浸润（图2A）。LPS组肺W/D比值升高，OSC治疗显著降低该比值（图2B）。LPS组BALF中细胞总数显著增加，OSC组显著减少（图2C）。流式检测显示，LPS组中性粒细胞比例显著升高（正常组0.13±0.03%），OSC治疗降低其比例（图2D-E）。ELISA检测表明，LPS组BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高，OSC治疗显著降低这些炎症因子水平（图2F-H）。

OSC抑制ALI小鼠细胞凋亡

TUNEL染色显示，LPS组肺组织凋亡细胞数量显著增加，OSC治疗显著减少凋亡细胞数量（图3A-B）。

OSC减少肺上皮细胞凋亡

MTT检测显示，OSC（5-320 μmol/L）对细胞活力无显著影响（图4A）；LPS显著降低细胞活力，OSC（40和80 μmol/L）预处理显著提高活力（图4B）。Annexin V/PI双染显示，LPS组凋亡细胞比例（4.23±0.05%）显著高于正常组（0.94±0.04%），OSC组（40 μmol/L: 1.15±0.05%; 80 μmol/L: 1.96±0.03%）显著降低凋亡比例（图4C）。

网络药理学预测与分子对接

获得OSC相关靶点263个，ALI相关靶点2289个，AEC相关靶点4614个；Venn图取交集得106个共同靶点（图5A）。KEGG富集分析显示23个靶点富集于PI3K-Akt和凋亡信号通路（图5B）。PPI分析筛选出核心靶点KIT、PIK3CA和Bcl-2（图5C）。分子对接显示OSC与KIT、PIK3CA和Bcl-2的结合能分别为-6.32、-7.84和-7.92 kJ/mol（图5E-G），表明强结合作用。

OSC上调KIT、p-PI3K、Bcl-2表达并下调BAX表达

Western blotting显示，LPS处理显著降低BEAS-2B细胞中KIT、p-PI3K和Bcl-2蛋白表达，升高BAX表达；OSC治疗逆转这些变化（图6A-D）。免疫荧光和RT-qPCR结果一致（图6E-P）。在ALI小鼠肺组织中，免疫组化显示LPS减少p-PI3K、KIT和Bcl-2阳性颗粒（黄色），增加BAX阳性颗粒；OSC治疗增加p-PI3K、KIT和Bcl-2表达，减少BAX表达（图7）。

Discussion

ALI是一种由感染、创伤等多种因素引起的复杂病理状态，目前无特效治疗。本研究通过LPS诱导的ALI小鼠模型和BEAS-2B细胞凋亡模型，发现OSC可能通过调控KIT/PI3K信号通路缓解ALI。

OSC抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子释放，减轻炎症反应；降低肺W/D比值，缓解肺水肿；减少中性粒细胞浸润和聚集，保护肺组织。此外，OSC预处理增强肺上皮细胞活力，抑制LPS诱导的凋亡，维护上皮屏障完整性。

网络药理学和分子对接预测KIT、PIK3CA和Bcl-2为核心靶点，实验验证OSC通过上调KIT/PI3K通路活化