MOF介导芦荟大黄素递送通过细胞焦亡与免疫抑制协同增强肝细胞癌免疫治疗

　　本综述系统阐述了MOF介导的芦荟大黄素（AE）靶向递送系统（AE-FeMn/FA）在肝细胞癌（HCC）治疗中的突破性应用。该纳米平台通过诱导细胞焦亡（pyroptosis）和协同免疫抑制剂BMS-202，重塑肿瘤免疫微环境（TME），显著增强抗肿瘤免疫应答，为HCC免疫治疗提供了新策略。

　　

Abstract

本研究针对肝细胞癌（HCC）传统疗法疗效有限的问题，旨在利用细胞焦亡（pyroptosis）缓解肿瘤免疫抑制微环境，增强全身免疫力并提高免疫治疗效果。研究重点聚焦于焦亡诱导剂、免疫治疗剂和药物递送策略的精准选择。

Materials and Methods

通过合成AE-FeMn/FA纳米颗粒，对其形态、粒径和Zeta电位进行了表征。评估了其在激活H₂O₂产生·OH方面的催化性能、触发细胞焦亡的能力以及体内外抗肿瘤效果。结合BMS-202，探索了其对PD-1/PD-L1复合物的抑制和焦亡的协同诱导作用。

Results

静脉注射的AE-FeMn/FA能够靶向HCC，控制释放AE触发焦亡和抗肿瘤免疫。BMS-202缓解了免疫抑制，增强了AE-FeMn/FA诱导的抗肿瘤反应，实现了协同免疫介导的癌细胞清除。

Conclusion

焦亡与增强的免疫治疗纳米平台相结合的协同方法显示出作为有效HCC免疫治疗策略的潜力，具有显著的临床转化前景。未来研究将优化平台并进行临床试验。

Introduction

免疫检查点阻断疗法（ICB）近年来呈指数级增长，为晚期恶性肿瘤患者带来了显著的临床获益和新颖的治疗策略。这种治疗方式通过直接靶向癌细胞并同时激活和招募免疫细胞，显著增强宿主的内源性抗肿瘤免疫防御。尽管癌症治疗取得了重大进展，但临床实践中仍存在许多关键挑战：大多数实体瘤患者对单药ICB治疗的反应率仍然较低。例如，肝细胞癌中对单药ICB的反应率低于20%，这与低肿瘤免疫原性和免疫抑制微环境的影响密切相关。此外，全身给药容易诱发免疫相关不良事件，而长期治疗中容易出现原发性或获得性耐药。大分子ICB抗体组织穿透性差，无法有效积聚在实体瘤的深层微环境中，从而进一步限制了治疗效果的充分发挥。值得注意的是，肿瘤免疫抑制微环境（TME）是一个重大障碍，它常常削弱免疫治疗干预的效果，限制治疗结果。TME具有独特的条件，包括缺氧应激、酸性细胞外环境和有限的营养可用性。这些因素共同改变免疫细胞活性并破坏肿瘤细胞中的关键信号转导网络，从而阻碍免疫系统识别和消灭恶性细胞的能力。一种新型的炎症性细胞死亡模式，即细胞焦亡，已被报道为一种由gasdermin诱导的细胞裂解介导的免疫辅助策略。这种生物学机制涉及细胞膜完整性的破坏，导致细胞内成分的释放。这些释放的物质触发细胞毒性淋巴细胞的激活，进而主动寻找并消除肿瘤细胞。细胞焦亡与肿瘤免疫治疗之间的相互作用已成为肿瘤学研究的焦点。这种机制显示出作为改善癌症治疗结果的有效方法的巨大潜力，为免疫调节策略提供了新的见解。

金属离子介导的免疫治疗，特别是利用过渡金属离子Fe³⁺和Mn²⁺，可以与肿瘤微环境中存在的过氧化氢相互作用，产生活性氧（ROS）。这些ROS不仅作为次级信号激活炎症小体，还促进化学动力学疗法（CDT）并诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。在焦亡过程中，免疫抑制细胞因子的分泌矛盾地促进了强大的免疫原性细胞死亡。这个过程启动了与肿瘤相关的抗原和肿瘤特异性抗原的释放，同时暴露激活免疫系统的“危险信号”。这进而激活树突状细胞成熟，诱导肿瘤特异性T细胞免疫反应，并最终根除肿瘤细胞。然而，体内游离的Fe³⁺和Mn²⁺的快速清除，以及肿瘤微环境中丰富的谷胱甘肽中和了活性氧，限制了免疫反应的效力。为了应对这一挑战，研究人员探索了Fe³⁺和Mn²⁺的递送策略，特别关注开发能够在肿瘤微环境中实现靶向递送和高效释放的纳米平台。金属有机框架（MOF）纳米颗粒因其巨大的比表面积和独特的多孔结构，已成为在ROS引发的焦亡中作为金属源和药物运输载体的高度有前途的候选者。这种独特的结构特征赋予它们高效封装和递送治疗剂的能力，同时能够控制释放触发焦亡途径所必需的金属。

芦荟大黄素（AE）是一种从自然界多种植物物种中提取的蒽醌分子，已成为科学调查的关键领域。其广泛的药理特性，包括抗炎、抗氧化和抑制肿瘤的能力，已将其推向药物发现和治疗开发研究的前沿。AE通过抑制恶性细胞中DNA、RNA和蛋白质的合成，阻断癌细胞的生长进程并限制癌细胞转移，展现出广泛的抗肿瘤特性。目前的研究已经探索了AE的纳米递送系统，如脂质体和聚合物纳米颗粒。这些研究证实纳米载体可以增强AE的水溶性，延长其循环时间并改善肿瘤积聚。然而，AE有限的水溶性和次优的生物利用度目前对其转化为临床实践构成了重大障碍，阻碍了其全部治疗潜力的实现。因此，研究提高其溶解度和优化其向肿瘤部位运输的不同方法至关重要。叶酸（FA）是一种天然配体，与叶酸受体（FR）结合，因其高亲和力、小尺寸和无毒性，作为纳米颗粒递送的靶向配体已被广泛研究。

基于上述见解，本研究采用FA修饰的FeMn-MOF作为载体：FA配体可以特异性结合在肿瘤细胞上高表达的叶酸受体，实现AE的主动靶向递送，从而减少脱靶毒性；MOF的多孔结构允许高效加载AE，并利用肿瘤微环境的特征（如酸性pH和高H₂O₂水平）触发精确的药物释放；同时，FeMn纳米骨架具有类芬顿催化活性，可以诱导ROS生成，并与AE固有的药理效应协同增强抗肿瘤功效。合成过程示意图见Scheme 1。纳米颗粒合成过程简单高效，显著增强了芦荟大黄素、Fe³⁺和Mn²⁺在水中的溶解度，同时还表现出优异的生物相容性。静脉给药后，AE-FeMn/FA纳米颗粒可以被运输并积聚在肿瘤部位，由于肿瘤微环境的弱酸性和还原条件，纳米颗粒迅速降解，释放出AE、Fe³⁺和Mn²⁺。这些金属离子（Fe³⁺和Mn²⁺）不仅通过形成ROS、caspase-3切割以及与AE联合诱导焦亡来诱导炎症小体激活，而且还增强了由ROS和焦亡触发的免疫原性细胞死亡。这种机制触发了额外树突状细胞的招募，使它们能够有效识别肿瘤细胞。随后，这个过程启动了抗原特异性T细胞侵入肿瘤微环境，最终建立起强大的抗肿瘤免疫反应。实验室和动物模型研究已经证明了我们设计的AE-FeMn/FA纳米颗粒在抑制肿瘤生长方面的显著优势，特别是当与小分子PD-1/PD-L1免疫抑制剂BMS-202联合使用时。因此，AE-FeMn/FA纳米颗粒的应用实现了双金属有机框架和AE诱导焦亡的协同免疫治疗效应，增强了免疫原性细胞死亡，并为免疫抑制肿瘤的治疗提供了一种新方法。

Synthesis and Characterization of AE-FeMn/FA

通过用柠檬酸（CA）还原掺杂锰的高锰酸钾（KMnO₄）成功制备了金属有机框架（FeMn-MOF）。随后，通过物理吸附将AE加载到FeMn-MOF框架中，并通过酰胺键连接将FA涂覆在其表面，最终形成AE-FeMn/FA纳米颗粒。TEM分析显示AE-FeMn呈现典型的菱形晶体结构，边缘清晰，分散性好，无明显聚集。FA修饰后，AE-FeMn/FA保留了菱形核心结构，粒径分布均匀（平均粒径：147 nm），分散状态稳定。进一步的元素分布分析表明，AE-FeMn/FA中的Fe和Mn元素均匀分布在菱形颗粒的核心区域，而N元素（源自FA的特征元素）主要富集在颗粒表面。这一元素证据证实了FeMn金属框架的成功合成和FA的有效修饰。AE的紫外吸收光谱在450 nm处显示出显著的特征峰，而单独的FeMn-MOF未显示任何AE特征峰，证实了AE的成功封装。高效液相质谱仪测得AE的负载率为40.55%。粒径和电位分析表明AE-FeMn/FA的粒径约为147.7 nm，带负电荷，表明其在血液循环中相对稳定。在模拟生理环境的pH 7.4 PBS中，AE释放极少，24小时内仅达到12.7%，表明其在血液中的稳定性。相反，在模拟肿瘤的酸性pH 5.5环境中，AE释放迅速，24小时内累积释放达74.28%，表明AE-FeMn/FA在酸性条件下快速降解，为控制药物释放奠定了基础。FeMn-MOF可以通过芬顿反应产生剧毒ROS。使用四甲基联苯胺（TMB）的体外实验证明FeMn-MOF能有效产生ROS，且随着AE-FeMn/FA浓度的增加而增加。AE-FeMn/FA在酸性条件、高TMB浓度和过量H₂O₂下也表现出增加的ROS生成。在肿瘤细胞中，ROS的产生通常伴随着谷胱甘肽（GSH）的消耗以调节氧化还原平衡。由于Fe和Mn的存在，细胞内GSH被进一步消耗。通过DTNB实验评估GSH消耗，显示AE-FeMn/FA消耗的GSH量随时间逐渐增加。比较各种纳米颗粒组的GSH消耗能力，发现在相同浓度下，AE-FeMn/FA表现出比单独FeMn显著更高的GSH降解，表明其有效消耗GSH。

Tumor Cell Uptake and Cytotoxicity of AE-FeMn/FA

基于AE-FeMn/FA的成功合成，该纳米颗粒具有小尺寸、血液中稳定性以及催化产生ROS和消耗GSH的能力。接下来，使用Hepa1-6小鼠肝癌细胞评估了制备材料的体外细胞毒性。为了阐明纳米颗粒与癌细胞的相互作用，将罗丹明标记的AE-FeMn/FA与Hepa1-6细胞共培养。荧光倒置显微镜分析显示，随着时间推移，细胞内红色荧光强度稳步上升。具体来说，荧光在孵育8小时后达到最大值，表明纳米材料在肿瘤细胞内有效积累。这一结果表明Hepa1-6细胞成功摄取了纳米颗粒，为进一步的细胞毒性研究奠定了基础。流式细胞术分析的定量数据验证了荧光显微镜观察结果。受显著的细胞摄取能力启发，我们评估了不同靶向肿瘤药物对Hepa1-6细胞的细胞毒性。活细胞/死细胞染色证明了AE-FeMn/FA对Hepa1-6细胞的显著杀伤作用。培养24小时后，AE-FeMn和AE-FeMn/FA处理组的细胞存活能力显著低于FeMn组，证明AE和FA的靶向协同效应增强了肿瘤细胞的杀伤效果。与正常肝细胞THLE-2共孵育显示AE-FeMn/FA对THLE-2细胞活力没有影响，表明其肿瘤特异性细胞毒性。此外，细胞增殖实验和Tunel染色进一步证实了AE-FeMn/FA对肿瘤细胞的显著杀伤和增殖抑制作用。流式细胞术结果也支持这一结论。总之，这些数据表明AE-FeMn/FA可以选择性靶向Hepa1-6细胞并在细胞内酸性环境中诱导ROS。

AE-FeMn/FA Induced Pyrodeath of Hepa1-6 Cells, Which Resulted in Immunogenic Cell Death

受AE-FeMn/FA在体外观察到的抗肿瘤效果激励，我们对Hepa1-6细胞中的细胞内机制进行了研究。已经证明，在肿瘤的酸性环境中，包括Fe²⁺和Mn²⁺在内的过渡金属离子与H₂O₂相互作用，通过芬顿或类芬顿反应产生大量ROS（例如·OH）。这些反应在肿瘤组织中起着至关重要的作用，并可以影响化学动力学疗法（CDT）介导的细胞毒性。过渡金属离子有效诱导肿瘤细胞死亡。为了探索AE-FeMn/FA在肿瘤细胞中的ROS产生能力，我们使用了DCFH-DA探针。结果表明，与其他组相比，AE-FeMn/FA显著催化肿瘤细胞中ROS的产生，表明其促进ROS产生的能力。类似地，流式细胞术结果显示，用AE-FeMn/FA处理的肿瘤细胞中ROS荧光信号更强。由于Mn²⁺和Fe³⁺的存在，·OH的产生伴随着GSH的消耗，维持动态氧化还原平衡。实验结果显示，用不同纳米颗粒处理的溶液中GSH消耗和·OH产生是一致的。总之，AE-FeMn/FA可以调节肿瘤细胞中的氧化还原状态，并通过促进ROS产生和抑制GSH水平来调节Hepa1-6细胞。接下来，我们使用JC-1荧光染料检查细胞死亡机制并监测线粒体膜电位（MMP）的变化。JC-1在正常线粒体中积累并发出红色荧光，而在受损线粒体中则以单体形式存在，导致红色荧光变为绿色。对照组和AE-FeMn/FA组的荧光强度比（G/R）分别约为0.14和0.96，反映了细胞的线粒体状态，并揭示了细胞死亡过程中的一个重要机制。细胞焦亡的特征是细胞膨胀、细胞膜裂解和细胞内成分的排出。此外，AE可以通过gasdermin E（GSDME）触发焦亡，其激活由caspase-3切割形成孔洞介导。用AE-FeMn/FA处理Hepa1-6细胞后，NLRP3显著上调，表明焦亡被激活。如图4A所示，AE-FeMn/FA处理后，Hepa1-6细胞的质膜表现出显著肿胀，导致细胞质膜破裂和细胞内物质释放。随后，我们通过Western blotting分析了Hepa1-6细胞中与焦亡相关的机制，结果表明AE-FeMn/FA诱导的焦亡更为明显。焦亡属于炎症性细胞死亡模式，释放各种炎症因子并激活抗肿瘤免疫反应。为了验证AE-FeMn/FA的体外免疫激活效果，我们评估了ICD效应，以及HMGB1和CRT作为生物标志物的表达。结果显示AE-FeMn/FA显著增强了ICD效应。此外，Hepa1-6细胞中HMGB1的表达与通过Western blot分析获得的免疫荧光结果一致。

In vivo Anti-Tumor Effects of AE-FeMn/FA

焦亡诱导剂在肿瘤中的积聚对于增强抗肿瘤效果和触发免疫反应至关重要。为了评估体内肿瘤治疗的有效性，我们用荧光探针Cy5.5标记了AE-FeMn和AE-FeMn/FA，并使用IVIS光谱监测了它们在Hepa1-6荷瘤小鼠中的生物分布。结果表明，与AE-FeMn相比，AE-FeMn/FA在肿瘤部位积累更快、程度更大，并且在注射后持续48小时。此外，注射48小时后收集主要器官进行生物发光成像分析。肿瘤部位AE-FeMn/FA的荧光强度高于AE-FeMn，表明AE-FeMn/FA具有良好的肿瘤靶向性和持续滞留效果，这为后续治疗实验奠定了基础。在Hepa1-6荷瘤小鼠中，我们进一步评估了金属纳米颗粒的抗肿瘤功效，以探索其作为实体瘤免疫治疗策略的潜力。接种Hepa1-6肿瘤后，每三天静脉注射不同的治疗剂（PBS、FeMn、AE、AE-FeMn、AE-FeMn/FA），并且每天测量肿瘤大小和小鼠体重。结果显示，PBS处理组的肿瘤体积持续增加，而AE-FeMn/FA组的肿瘤进展被显著抑制。治疗后的肿瘤称重结果表明，AE-FeMn/FA组的肿瘤重量明显低于PBS组和单金属纳米颗粒组，进一步证实了联合治疗的增强抗肿瘤效果。为了评估纳米颗粒的生物安全性，我们监测了小鼠的体重，在整个治疗过程中体重变化很小。此外，体外溶血实验证明AE-FeMn/FA不会引起溶血。HE染色用于评估纳米颗粒对小鼠主要器官的影响，结果显示没有明显的病变。而且，AE-FeMn/FA组的生化指标与对照组相比没有显著差异。这些发现表明AE-FeMn/FA表现出良好的生物安全性。为了阐明AE-FeMn/FA的抗肿瘤机制，我们对肿瘤标本进行了苏木精和伊红组织学染色以及基于TUNEL的免疫荧光染色。研究结果表明，AE-FeMn/FA组的组织损伤面积最大，与肿瘤体积的变化一致。TUNEL染色进一步证实了肿瘤组织的严重破坏。

Study on Pyrodeath Mechanism of AE-FeMn/FA in Vivo

为了进一步阐明AE-FeMn/FA在动物模型中通过焦亡细胞死亡发挥肿瘤抑制作用的机制，我们对治疗后肿瘤切片上的NLRP3和切割的Caspase-3（C-Caspase-3）蛋白进行了免疫荧光分析。结果显示，在AE-FeMn/FA组的肿瘤组织中，NLRP3和C-Caspase-3的红色荧光信号显著上调。同时，基于体外观察到的显著ICD效应，我们检测了Hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织中HMGB1的表达。免疫荧光结果显示，AE-FeMn/FA治疗组细胞外HMGB1释放程度更高，表明纳米颗粒在体内也发挥ICD功效。此外，对焦亡相关炎症因子的ELISA检测表明，AE-FeMn/FA治疗组血清中IL-18和IL-1β水平显著升高。这些发现进一步支持了金属纳米颗粒通过焦亡发挥肿瘤抑制作用的结论，这与体外观察到的抗肿瘤数据一致。当ICD效应发生在肿瘤细胞中时，它会触发树突状细胞的成熟过程，并促进其向T细胞呈递抗原的能力，从而激活效应T细胞反应。在本研究中，ELISA测定表明AE-FeMn/FA组诱导了细胞因子TNF-α的释放，这一结果可以进一步激活细胞毒性T细胞的增殖。随后的流式细胞术分析证实，在AE-FeMn/FA组中成熟树突状细胞（DCs）的数量显著增加，同时CD8⁺ T细胞的比例也大幅升高。

AE-FeMn/FA Combined with Immunosuppressant BMS-202 Enhanced Anti-Tumor Immunity

PD-1在T淋巴细胞激活和扩增期间存在，它通过调节细胞内信号传导来降低效应T淋巴细胞的功能，从而对肿瘤免疫反应产生负调节，导致肿瘤细胞免疫逃逸。研究表明，小分子抑制剂BMS-202可以阻碍PD-1/PD-L1结合并促进T细胞激活。为了研究AE-FeMn/FA与BMS-202联合应用对抗肿瘤免疫的影响，我们建立了Hepa1-6-Luc荷瘤小鼠模型，并将其随机分为四个亚组（n=6）：对照组、BMS-202组、AE-FeMn/FA组和AE-FeMn/FA+BMS202组。模型建立和治疗方案如图7A所示。在每个组中，每三天评估一次肿瘤尺寸和动物体重。研究结果表明，AE-FeMn/FA和BMS-202的混合物显著抑制了肿瘤生长，这通过生物发光成像系统在不同时间点的肿瘤体积评估得到证实。这一结果得到了肿瘤体积变化的进一步支持。此外，对照组的存活率在第45天为0%，而联合治疗组的存活率在观察期结束时仍保持在80%，并且对小鼠体重影响很小。切除的肿瘤重量也支持这些结果，表明联合免疫剂进一步增强了AE-FeMn/FA的抗肿瘤效果。BMS-202主要通过抑制PD-1/PD-L1复合物的组装来缓解免疫抑制。为了进一步验证AE-FeMn/FA+BMS202的免疫治疗功效，我们检测了不同疗法后血清相关细胞因子。结果表明，AE-FeMn/FA+BMS202组的TNF-α和IFN-γ水平显著高于其他组，刺激了细胞毒性T细胞浸润并诱导了全身免疫反应。接下来，我们使用流式细胞术评估了AE-FeMn/FA与BMS-202联合对CD8⁺T细胞比例的影响。研究结果表明，AE-FeMn/FA+BMS202组中CD8⁺ T细胞的比例达到43%，显著高于AE-FeMn/FA组的35.5%，表明联合治疗显著增加了CD8⁺ T细胞浸润水平。

Discussion

总之，我们成功开发了一种酸响应性金属有机递送纳米颗粒AE-FeMn/FA，它能有效激活NLRP3介导的焦亡通路。通过释放肿瘤特异性金属离子，该纳米颗粒诱导产生细胞毒性ROS，诱导肿瘤细胞发生程序性细胞死亡。此外，负载的AE进一步增强了焦亡效应，导致与ICD相关的细胞质内容物释放。这个过程刺激树突状细胞成熟，从而诱导免疫原性。此外，添加小分子免疫检查点抑制剂BMS-202，通过抑制PD-1/PD-L1相互作用，进一步增强了AE-FeMn/FA刺激的抗肿瘤免疫反应。这种将焦亡与小分子免疫检查点抑制剂相结合的联合策略，激活了先天免疫反应，并将免疫抑制的肿瘤微环境转变为免疫原性环境。这些发现为HCC的免疫治疗提供了新策略，并具有重要的临床转化潜力。这项工作具有重要的临床意义，并为未来的研究提供了新的概念和方向。尽管本研究证实了AE-FeMn/FA在肝细胞癌中的治疗潜力，但其临床转化的安全性需要仔细评估。值得注意的是，高浓度Mn²⁺的神经毒性在之前的几项研究中已有报道，这提醒我们需要严格界定其安全应用范围。尽管本研究目前的数据显示Mn²⁺对其他主要器官没有造成明显损伤，但仍存在一定的局限性：首先，尚未对中枢神经系统进行更具体的安全性评估；其次，缺乏长期暴露模型可能无法排除慢性累积神经损伤的风险。然而，本研究使用的Mn²⁺浓度在当前实验条件下具有相对较高的安全性。Fan等人利用光触发纳米酶成功重塑了缺氧和免疫抑制的肿瘤微环境，这为我们的研究提供了宝贵的见解：我们建议在未来的研究中将光触发机制引入MOF介导的递送系统，以实现精确可控的药物释放。这种设计不仅增强了治疗效果，还有助于减轻Mn²⁺的潜在神经毒性作用。尽管如此，我们充分认识到对中枢神经系统进行系统评估的必要性。因此，未来的研究将进一步关注其长期安全性，为Mn²⁺的临床应用提供更全面的证据。

此外，与帕博利珠单抗等大分子ICB抗体相比，BMS-202具有分子量小、组织穿透力强的优点，使其更容易通过纳米载体在实体瘤深处富集。然而，它半衰期短，容易引起脱靶效应。因此，本研究使用AE-FeMn/FA纳米平台进行递送，通过缓释延长作用时间，并通过靶向减少对正常组织的影响。对于未来的转化研究，我们计划沿着从细胞水平的具体验证到动物模型的长期毒性评估，再到临床前药代动力学优化的路径推进。然而，纳米载体的生物相容性标准以及小分子与载体之间的批次稳定性等实际挑战需要解决，这将是后续研究的关键突破方向。Luo等人构建了一种具有优异靶向能力和生物相容性的仿生靶向共递送系统。这种仿生设计策略可以适用于MOF介导的芦荟大黄素递送系统。例如，可以用源自肿瘤细胞或相关细胞的膜成分包被MOF材料；或者，可以修饰MOF以特异性识别肝细胞癌细胞的表面标志物。此类修饰将实现更精确的靶向递送，增强芦荟大黄素在肿瘤部位的积聚，从而提高治疗效果。

同时，本研究中“联合免疫抑制治疗缓解免疫抑制”的结论主要得到间接证据的支持。当前研究的一个主要局限性在于未能直接检测调节性T细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的表型变化，以及缺乏对肿瘤组织中PD-L1表达水平的直接测量。为了解决这些局限性，我们计划在未来的研究中进一步验证联合治疗对PD-1/PD-L1通路和肿瘤免疫微环境的调节机制。具体来说，我们将检测肿瘤组织中的PD-L1蛋白和mRNA表达水平，进行PD-L1中和实验，并补充Tregs和TAMs的表型分析，以实现更全面的验证。

Disclosure

研究人员声明，没有公认的财务利益冲突或个人关联可能看似影响了本文中呈现的研究。