ERG3基因突变介导耳念珠菌获得性两性霉素B耐药性的机制与临床意义研究

　　本文深入探讨了一例由ERG3基因移码突变导致的耳念珠菌（Candidozyma auris）获得性两性霉素B（Amphotericin B）耐药临床案例。研究通过全基因组测序（WGS）、CRISPR基因编辑、固醇谱分析和表型筛选等多重技术手段，证实ERG3突变（G71fs→P132）是耐药表型的主要决定因素，并发现ERG4无义突变（L106）可能起辅助作用。该工作首次在临床分离株中验证了ERG3突变与两性霉素B耐药性的因果关系，揭示了固醇代谢通路改变引发的适应性代价，为耐药机制研究和临床诊断提供了重要依据。

　　

引言

耳念珠菌（Candidozyma auris，原Candida auris）自2009年首次被发现以来，已成为全球公共卫生领域的重大威胁。2019年，美国疾病控制与预防中心（CDC）将其列为“紧急威胁”级别的病原体，这是首次有真菌获此评级。该菌具有多重耐药性、易在医疗机构内传播以及高死亡率（30%–60%）等特点，尤其对免疫缺陷患者构成严重风险。目前，针对念珠菌感染的三大主流抗真菌药物中，耳念珠菌对氟康唑（唑类）的耐药率高达80%–93%，对棘白菌素类耐药率为5%–7%，而对两性霉素B（多烯类）的耐药率约为30%–50%。

两性霉素B自1953年从结节链霉菌（Streptomyces nodosus）中分离以来，因其广谱抗真菌活性而被广泛用于系统性真菌感染的治疗。其作用机制主要通过与真菌细胞膜中的麦角固醇（ergosterol）结合，破坏膜通透性，并可引发氧化损伤。然而，尽管该药已临床应用七十余年，耐药案例仍极为罕见。在耳念珠菌中，此前唯一被确认的获得性两性霉素B耐药机制是由ERG6基因的插入缺失突变（indel）所介导。此外，曾有研究在单一临床分离株中发现ERG3的无义突变可能与耐药相关，但未经过功能验证。

材料与方法

本研究从一例76岁女性患者体内连续分离到两株耳念珠菌：第一株（LNV001）于2022年7月从支气管灌洗液中获得，第二株（LNV002）于同年9月从尿液中获得。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定确认。

研究人员对两株菌进行了全基因组测序（NovaSeq 6000平台，读长2×151 bp），并通过生物信息学工具（TheiaEuk、GAMBIT、kSNP3和Snippy）进行de novo组装、单核苷酸多态性（SNP）分析和进化分型。结果显示两株菌同属Clade III，但存在九个编码区突变，其中最为引人注目的是ERG3基因上一个10 bp的缺失导致移码突变（G71fs），进而提前形成终止密码子（P132），以及ERG4基因上的无义突变（L106）。

为验证这些突变的功能，研究团队利用EPIC（Episomal Plasmid-Induced Cas9）基因编辑系统对LNV002菌株进行基因修复。他们成功构建了ERG3单基因回补株（LNV002_ERG3^WT）和ERG3/ERG4双基因回补株（LNV002_ERG3^WT, ERG4^WT），但未能获得独立的ERG4单基因回补株。

药敏试验采用微量肉汤稀释法（BMD）和Etest试纸条法，参照CLSI M27-A4方案和CDC建议进行。此外，还通过表型微阵列（Biolog PM1和PM2a板）分析菌株在不同碳源下的生长曲线，并采用气相色谱－质谱联用（GC/MS）技术全面分析固醇组成。

结果

病例描述与基因突变分析

LNV001对两性霉素B敏感（MIC = 0.19 mg/L），而LNV002表现出高度耐药（MIC > 32 mg/L）。全基因组比较发现，两菌株之间存在九个非同义突变，其中ERG3和ERG4的突变位于固醇生物合成通路，与两性霉素B的作用机制直接相关。

基因回补恢复药物敏感性

CRISPR介导的ERG3回补使两性霉素B MIC从＞32 mg/L显著降至0.38 mg/L（Etest法）或2 mg/L（BMD法），表明ERG3突变是耐药性的主要决定因素。双基因回补（ERG3和ERG4）并未进一步显著降低MIC，提示ERG4突变的作用较为有限。

固醇谱揭示代谢重塑

GC/MS分析显示，敏感株LNV001的固醇组成以麦角固醇（45.2%）和羊毛固醇（39.7%）为主。相反，耐药株LNV002完全缺乏麦角固醇，其主要固醇成分为ergosta-7,22,24(28)-trienol（53.7%）、表固醇（episterol，17.3%）和羊毛固醇（17.3%）。在ERG3回补株中，麦角固醇仍未检出，其主要固醇为ergosta-5,7,22,24(28)-tetraenol（49.2%），而双基因回补株则成功恢复了麦角固醇的合成（62.8%）。

适应性代价的评估

表型微阵列分析显示，与敏感株相比，耐药株LNV002在14种碳源上存在显著的生长缺陷，其中β-D-阿洛糖、苯乙胺、木糖醇、α-酮戊二酸等碳源上的差异最为明显。这表明耐药突变确实带来了代谢适应性上的代价。

讨论

两性霉素B在应对耳念珠菌感染中的关键地位

随着唑类耐药性的普遍蔓延以及棘白菌素类耐药菌株的快速增加（2021年CDC报告显示其耐药病例数较2020年增长了三倍），两性霉素B已成为治疗多重耐药耳念珠菌感染的“最后防线”药物之一。因此，解析其耐药机制对于临床用药和感染控制至关重要。

CRISPR验证与耐药机制解读

本研究首次在临床分离株中通过基因编辑技术证实ERG3突变是导致两性霉素B获得性耐药的主要原因。值得注意的是，研究人员未能获得独立的ERG4回补株，推测ERG3突变可能先发生，而ERG4突变随后出现以补偿由ERG3功能缺失引发的适应性缺陷。此外，其他突变（如转录调节因子ADR1同源基因的错义突变）可能也在微调耐药表型中发挥作用。

固醇替代与药敏恢复的悖论

尽管ERG3回补株仍无法合成麦角固醇，但其对两性霉素B的敏感性却得以恢复。这表明两性霉素B可能不仅能与麦角固醇结合，还能与其他晚期固醇（如ergosta-5,7,22,24(28)-tetraenol）相互作用，从而发挥杀菌效应。这一发现拓展了对多烯类药物作用机制的理解。

耐药性的适应性代价与进化权衡

耐药株在多种碳源上表现出的生长缺陷印证了“适应性代价”的存在。然而，耳念珠菌似乎能够通过其他突变或表观遗传调控来部分补偿这种代价，从而使得耐药菌株得以在医院环境中存活和传播。

结论

本研究通过综合运用基因组学、基因编辑、代谢组学和表型组学方法，证实了ERG3基因突变是介导耳念珠菌获得性两性霉素B耐药的关键分子事件。这一发现不仅深化了对耳念珠菌耐药机制的理解，也为未来开发快速分子诊断工具、指导临床用药和制定感染控制策略提供了重要的科学依据。面对耳念珠菌的不断演变和传播，加强抗菌药物 stewardship 和开发新型抗真菌药物显得愈发紧迫。