非细胞毒性多粘菌素衍生物增强抗生素对抗多重耐药革兰氏阴性菌的作用

　　本综述重点探讨了针对多重耐药（MDR）革兰氏阴性菌的新型治疗策略。研究团队设计并合成了一系列基于多粘菌素B3（PMB3）的非肾毒性衍生物，其中化合物1（以2,3-二氨基丙酸（Dap）取代所有2,4-二氨基丁酸（Dab）残基）在体外展现出极佳的安全性（对HK-2和RPTEC/TERT1肾细胞无毒性）和强大的外膜（OM）渗透增强能力。它能与六大类抗生素（如利福平、zoliflodacin、普那霉素等）协同作用，显著降低其最低抑菌浓度（MIC），甚至低于临床折点，从而恢复其对MDR Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii等病原体的活性。尤其与新型抗生素zoliflodacin的联合疗法展现出快速杀菌效应，为应对严峻的抗生素耐药危机提供了极具前景的增效剂（Potentiator）候选分子。

　　

引言：多重耐药（MDR）细菌的日益流行对全球公共卫生构成了严重威胁，将世界推向了后抗生素时代的边缘。面对这一挑战，开发抗生素增效剂（Potentiator）成为一种关键策略，这类“辅助分子”本身几乎没有或仅有很弱的抗菌活性，但能够通过克服细菌的耐药机制，使细菌对伴侣抗生素重新敏感。它们可以抑制外排泵、抑制抗生素降解酶或改善膜通透性等，其优点在于不易诱发耐药性。革兰氏阴性菌因其外膜（OM）作为强大的渗透屏障而尤其难以治疗，这使得外膜渗透剂（Outer Membrane Permeabilizers）的开发显得尤为重要。多粘菌素（Polymyxins）是一类能够渗透细菌膜的代表性分子，但由于其肾毒性和神经毒性，临床应用受限。因此，当前的研究重点在于开发非肾毒性和非神经毒性的多粘菌素，不仅作为独立药物，也作为增强伴侣抗生素活性的增效剂。

设计与合成多粘菌素衍生物：本研究基于多粘菌素B₃（PMB₃）支架，旨在通过调节其整体疏水性、正电荷和碱度来改善其安全性而不损害其外膜渗透能力。化合物1通过用更短的类似物2,3-二氨基丙酸（Dap）取代所有五个2,4-二氨基丁酸（Dab）残基来降低疏水性。为了增强外膜渗透能力，将化合物1中的Dap胺转化为胍基（GDap）得到碱性更强的化合物2。为了同时降低疏水性和正电荷，用四个Dap和一个天冬氨酸（Asp）取代五个Dab得到化合物3。为了单独研究降低正电荷的影响，用Asp取代Dab³，保留其余四个Dab，得到化合物4。所有化合物均通过固相肽合成（SPPS）制备线性保护肽，在溶液中环化，并通过氢解脱除苄氧羰基（Cbz）保护基。化合物2则通过将化合物1胍基化并随后脱除叔丁氧羰基（Boc）保护基得到。

肾细胞系中的细胞毒性：在HK-2和RPTEC/TERT1肾细胞系中评估了合成化合物的毒性。化合物1、3和4在最高测试浓度200 μM下相对无毒，细胞存活率约为60%–90%。然而，化合物2的毒性显著，与PMB相似甚至更强。其中，化合物3的存活率与无毒对照F230相当，在两种细胞系中表现最佳。化合物1的50%细胞毒性浓度（CC₅₀）远高于其作为增效剂的工作浓度（≤8 μg/mL或≤5 μM），表明其具有宽大的安全窗口。

野生型革兰氏阴性菌的抗菌活性：评估了低毒化合物1和3的 standalone 抗菌活性。与PMB相比，化合物1对野生型Pseudomonas aeruginosa PAO1无活性（MIC >128 μg/mL），对Acinetobacter baumannii ATCC 17978有中等活性（MIC为16 μg/mL），但令人惊讶地保留了对抗野生型Escherichia coli ATCC 25922的活性（MIC为0.5–1 μg/mL）。化合物3对所有测试的野生型革兰氏阴性菌均无活性（MIC >128 μg/mL）。

野生型革兰氏阴性菌的抗生素增效作用：使用棋盘法评估了化合物1和3对六种抗生素的增效能力。在P. aeruginosa PAO1和A. baumannii ATCC 17978中，化合物1（工作浓度通常为8 μg/mL或5 μM）与所有测试的抗生素持续协同作用（FIC指数≤0.5），仅对A. baumannii中的左氧氟沙星例外（相加作用）。增效倍数高达≥512倍，并能将利福平和普那霉素的MIC降至其解释性敏感性折点（1 μg/mL）以下。相比之下，化合物3仅显示出相加相互作用。

革兰氏阴性菌临床分离株的抗菌活性：在MDR和广泛耐药（XDR）临床分离株中评估了化合物1的 standalone 活性。它对MDR/XDR P. aeruginosa无活性（MIC >128 μg/mL），对MDR但粘菌素敏感的A. baumannii具有中等活性（MIC 16–32 μg/mL）。对于肠杆菌目临床分离株，化合物1对MDR Klebsiella pneumoniae无活性，但有趣地保留了对MDR但粘菌素敏感的E. coli和Enterobacter cloacae某些菌株的活性（MIC 0.5–1 μg/mL）。

临床分离株中的抗生素增效作用：在MDR和化合物1耐药的临床分离株中进一步评估了化合物1与六种抗生素的协同作用。在MDR/XDR P. aeruginosa、MDR A. baumannii和MDR肠杆菌目中，抗生素增效作用在很大程度上得以保留，特别是对于那些外膜渗透性有限的抗生素，如利福平、zoliflodacin和普那霉素（增效高达≥2048倍）。相比之下，能够通过被动扩散和/或孔蛋白摄取克服渗透屏障的抗生素（如头孢他啶、左氧氟沙星和米诺环素）的活性更难进一步增强。在粘菌素耐药菌株中，增效作用通常减弱或消失，表明脂多糖（LPS）修饰也影响了化合物1有效渗透外膜的能力。总体而言，化合物1在14株临床分离株中，与利福平在13株（93%）、与zoliflodacin和普那霉素在12株（86%）、与米诺环素在8株（57%）、与头孢他啶和左氧氟沙星在5株（36%）中发生协同作用。重要的是，它使大多数测试的利福平耐药菌株（12/16, 75%）对利福平敏感（MIC低于折点），并扩展了zoliflodacin和普那霉素的活性谱。

临床分离株P. aeruginosa 259-96916和A. baumannii AB027的时间杀灭动力学：为了确定化合物1与zoliflodacin联合的杀菌速率，进行了时间杀灭动力学实验。在P. aeruginosa 259-96916中，8 μg/mL化合物1单独使用可抑制生长，但与0.5 μg/mL zoliflodacin联合仅产生抑菌效果，而与8 μg/mL zoliflodacin联合则在24小时内实现了完全灭菌。在A. baumannii AB027中，单药治疗效果有限，但化合物1与0.5或8 μg/mL zoliflodacin联合在8小时内几乎根除了细菌（0.5 μg/mL组在24小时出现轻微再生长的迹象）。与最有效的单药治疗相比，联合治疗在24小时后显示出≥2 log₁₀的菌落数减少，证实了协同相互作用。

化合物1的外膜渗透作用机制：通过两个实验验证了其作用机制。首先，化合物1无法与利福平在缺乏LPS的革兰氏阳性菌（如methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium）中产生协同作用，表明其作用依赖于LPS。其次，在富含Mg²⁺（25 mM）的培养基中，Mg²⁺与多粘菌素竞争结合LPS，导致化合物1对zoliflodacin的增效作用在P. aeruginosa PAO1中完全丧失，在A. baumannii ATCC 17978中减弱（2倍）。这些结果共同表明，化合物1通过其与LPS的相互作用诱导外膜渗透，从而增强抗生素活性。

FBS补充培养基中的抗生素增效作用：评估了血清蛋白结合对增效作用的影响。随着胎牛血清（FBS）浓度的增加，化合物1对zoliflodacin的增效作用逐渐减弱。在P. aeruginosa PAO1中，25% FBS时增效作用丧失（变为相加）。在A. baumannii ATCC 17978中，50% FBS时增效作用才变为相加。这表明血清蛋白结合会影响联合疗法的效力，对P. aeruginosa的影响更为显著。

神经细胞系中的细胞毒性：除了肾细胞毒性筛选外，还在神经细胞系U-87 MG和SK-N-SH中评估了先导化合物1的毒性。然而，在这些细胞系中，即使在最高测试浓度下，化合物1和PMB均未表现出明显的毒性（存活率超过100%），表明这些细胞系可能不是评估多粘菌素神经毒性的合适模型。

讨论：多粘菌素的整体疏水性、正电荷和碱度影响其毒性和外膜渗透能力。降低疏水性（化合物1）或正电荷数量（化合物4）可显著提高细胞存活率。同时降低两者（化合物3）可进一步改善安全性。将化合物1胍基化（化合物2）会增加碱性从而导致毒性增加，这与之前的发现一致。化合物1抗菌活性的丧失（E. coli除外）证实了Dab残基在维持抗菌活性中的重要性。用Asp取代Dab³（化合物3）完全消除了抗菌活性，表明在PMB支架中引入羧基会减弱与LPS的相互作用。化合物1与抗生素的协同作用，特别是对那些外膜渗透性有限的抗生素（如利福平、zoliflodacin、普那霉素）更为明显，凸显了其作为外膜渗透剂的作用。对临床分离株的研究表明，抗生素增效作用在很大程度上得以保留，但在粘菌素耐药菌株中通常会减弱。化合物1与zoliflodacin的联合疗法在时间杀灭实验中显示出快速杀菌活性。机制研究证实其通过LPS相互作用渗透外膜。血清蛋白结合会降低其体内效力。先导化合物1对肾细胞无毒，对某些肠杆菌目菌株具有特异性抗菌活性，能持续增强多种抗生素对抗MDR革兰氏阴性菌的活性，并能与zoliflodacin产生快速杀菌组合效应，是应对MDR感染的极有前景的抗生素增效剂候选物。