氯法齐明体外诱导结核分枝杆菌对德拉马尼和普托马尼耐药性的机制与临床意义研究

　　本综述系统阐述了氯法齐明（CFZ）体外暴露如何通过选择fbiA、fbiC或fbiD等基因突变（尤其在获得Rv0678突变后），诱导结核分枝杆菌对硝基咪唑类药物（德拉马尼DLM/普托马尼PMD）产生交叉耐药。尽管体内机制尚待验证，作者基于现有证据主张硝基咪唑耐药不应作为CFZ使用的排除标准，为耐药结核病治疗策略提供了重要理论依据。

　　

ABSTRACT

体外实验表明，结核分枝杆菌暴露于氯法齐明（clofazimine）后，在可获得确定性的情况下，会先获得Rv0678突变，继而筛选出对德拉马尼（delamanid）和普托马尼（pretomanid）的耐药性，并伴随fbiA、fbiC或fbiD基因的突变。这种现象在体内以及Rv0678野生型背景中是否同样存在，尚需进一步研究。然而，基于现有证据，我们提出硝基咪唑类（nitroimidazole）耐药不应被视为使用氯法齐明的排除标准。

INTRODUCTION

氯法齐明是治疗耐利福平结核分枝杆菌的B组药物，并被纳入世界卫生组织（WHO）新推荐的6或9个月全口服方案中。迄今为止，已知的主要氯法齐明耐药机制是Rv0678基因的突变，该基因是MmpS5-MmpL5外排泵的负调节因子；而pepQ（Rv2535c）突变则较为罕见（这两种机制均导致对贝达喹啉的交叉耐药）。尽管文献中曾将Rv1979c与氯法齐明耐药相关联，但WHO突变目录至今尚未承认该基因的任何突变是氯法齐明耐药的标志物。六个非必需基因（即ddn [Rv3547]、fbiA [Rv3261]、fbiB [Rv3262]、fbiC [Rv1173]、fbiD [Rv2983]和fgd1 [Rv0407]）是德拉马尼和普托马尼活化所必需的，因此，这些基因的失活通常会导致对两种硝基咪唑类药物的交叉耐药。Waller等人是第一个也是迄今为止唯一一个证明氯法齐明可通过fbiA和fbiC突变在体外筛选出结核分枝杆菌对普托马尼高水平耐药的团队。本研究旨在进一步探究氯法齐明的这一特性。

Waller等人使用源自谱系4 H37Rv的减毒营养缺陷型亲本菌株，在单轮筛选中使用三种不同浓度的氯法齐明后，获得了fbiA和fbiC突变，而Rv0678保持野生型。基于使用相同Rv0678野生型亲本营养缺陷型的CRISPR干扰技术，他们发现转录抑制fbiA、fbiB、fbiC、fbiD和fgd1会使氯法齐明的最低抑菌浓度（MIC）增加约两倍，而普托马尼的MIC则根据所抑制基因的不同增加5至40倍。相比之下，当ddn表达被抑制时，氯法齐明的MIC没有变化，尽管这种抑制与普托马尼MIC增加46倍相关。这些发现在杀菌活性试验中得到印证。德拉马尼和普托马尼的共同靶点dprE2（Rv3791）以及其他近期描述的潜在耐药基因未被研究。尽管Waller等人未进行正式测试，但这些fbiA和fbiC突变体很可能对德拉马尼交叉耐药。

在Ismail等人的研究中，我们报告了涉及递增氯法齐明浓度传代的体外筛选实验的结果。在分析经过四次传代后源自谱系4 H37Rv ATCC 27294参考菌株的群体时，我们发现，在获得Rv0678移码突变后，很可能又筛选出了fbiC的非同义突变和fbiD缺失。使用谱系2菌株R1进行的等效实验产生了两种不同的Rv0678突变以及两种fbiA突变，其获得顺序无法推断。由于Ismail等人当时的重点是贝达喹啉和氯法齐明耐药，当时未进行硝基咪唑类药物的抗菌药物敏感性试验。此后，我们使用最新的WHO临界浓度测定了德拉马尼和普托马尼的MIC，以确认这些fbiA和fbiD突变与对这两种药物的交叉耐药相关。

为了补充这些发现，我们分析了Snobre等人使用氯法齐明体外筛选出的谱系1突变体。在第一轮筛选中，筛选出了一个Rv0678移码突变，该突变导致贝达喹啉和氯法齐明的MIC升高，而德拉马尼和普托马尼的MIC没有增加。额外暴露于氯法齐明筛选出了fbiC Arg536Leu突变，该突变与使用WHO临界浓度判断的对德拉马尼和普托马尼的交叉耐药相关。此外，获得fbiC突变与氯法齐明MIC增加约两倍相关，这与Waller等人在Rv0678野生型背景中报告的幅度一致，而贝达喹啉的MIC未受影响。

我们的体外结果表明，氯法齐明可以在三种不同谱系（即1、2和4）中筛选出对德拉马尼和普托马尼的交叉耐药，但仅在获得Rv0678突变之后。这提出了一种可能性，即Waller等人观察到的在野生型Rv0678背景中氯法齐明与硝基咪唑类药物之间的联系可能是由于他们使用了营养缺陷型菌株。事实上，Waller等人报告的两倍MIC增加与Gurumurthy等人对卡介苗fbiC敲除突变体观察到的超敏性形成对比。需要来自临床菌株的数据来研究这一矛盾。例如，可以对因fbiA、fbiB、fbiC、fbiD或fgd1突变导致硝基咪唑交叉耐药且Rv0678为野生型的临床菌株进行氯法齐明MIC测试（例如，使用一些已知在任一种硝基咪唑类药物临床使用之前就出现的突变体）。此外，通过研究接受不含硝基咪唑类药物方案（如硝基咪唑类药物批准前的历史方案，或WHO新推荐的包含贝达喹啉、利奈唑胺、左氧氟沙星、氯法齐明和吡嗪酰胺的9个月全口服方案）治疗的患者系列培养物，可能会获得相关的见解。

鉴于这些不确定性，我们支持WHO当前将fbiA、fbiB、fbiC、fbiD和fgd1列为氯法齐明 tier 2 基因（即非 tier 1 耐药机制）并需要持续监测的分类。事实上，即使来自临床菌株的数据证实这五个硝基咪唑耐药基因导致氯法齐明MIC增加约两倍，我们认为，对于其他方案不可行的耐利福平结核病患者，不应被剥夺使用氯法齐明的机会。在有强有力的临床和/或药代动力学和药效学证据表明这些机制确实导致更差的治疗结局之前（例如，因为使用当前未针对结核病治疗优化的给药方案，氯法齐明需要数周才能达到稳态），这应保持不变。WHO在其第一版突变目录中使用了类似的理由。具体来说，WHO决定不将eis G?10A、C?12T和G?37GT启动子突变归类为阿米卡星耐药突变，因为它们仅导致约两倍的MIC增加，而它认为eis C?14T和rrs C1402T导致的四倍MIC增加对于当前15–20 mg/kg/天的阿米卡星剂量可能具有临床意义（即，在此之