高糖环境通过增强金黄色葡萄球菌聚集与耐药性加剧囊性纤维化气道感染

　　本研究发现，高糖环境（模拟CFRD）显著增加囊性纤维化（CF）气道上皮细胞模型中金黄色葡萄球菌（S. aureus）的生物膜聚集和利福平（RIF）耐药性，而葡萄糖竞争抑制剂2-脱氧葡萄糖（2DG）可逆转此效应。研究揭示了高血糖通过改变宿主-病原体互作促进抗生素耐药的新机制，为CF相关糖尿病（CFRD）合并感染的治疗提供了代谢干预新策略。

　　

引言

囊性纤维化（CF）是一种由CF transmembrane conductance regulator（CFTR）基因突变引起的遗传病，导致多器官黏液积聚和功能异常。在肺部，异常黏液清除障碍使患者易发生持续性细菌感染，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是最常见的病原体。约30%的CF患者会发展为CF相关糖尿病（CFRD），其高血糖状态可进一步升高气道表面液体（ASL）中葡萄糖浓度（最高达6.07 mM）。临床研究表明，高血糖与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染风险增加及预后不良显著相关，但其中机制尚未明确。

高糖ALI模型构建与验证

研究采用永生化非CF（16HBE）和CF（CFBE41o-）人气道上皮细胞，通过气-液界面（ALI）培养模拟人体气道环境。基底侧培养基分别设置正常血糖（5.5 mM葡萄糖）和高血糖（12.5 mM葡萄糖）条件。测定显示ASL葡萄糖浓度与临床患者支气管抽吸物数据高度一致：非CF正常糖组为0.5 mM，CF高糖组升至3.5 mM。使用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2DG）可显著降低ASL葡萄糖水平。经跨上皮电阻（TEER）和乳酸脱氢酶（LDH）检测证实，高糖及2DG处理未破坏上皮细胞完整性与活性。

高糖对炎症因子表达的影响

通过RT-qPCR检测白细胞介素（IL）-6、IL-8和IL-1β mRNA表达水平。结果显示，短期高糖暴露未显著改变非CF与CF细胞的炎症因子表达。CF细胞中IL-1β基础表达高于非CF细胞（与CF慢性炎症特征一致），但高糖处理未进一步加剧该趋势。2DG处理仅在CF细胞中引起IL-1β轻度上升，提示代谢抑制可能对CF细胞施加额外应激。

高糖促进S. aureus聚集与生物膜形成

以USA100 MRSA菌株感染ALI模型6小时后，细菌总负荷在各组间无显著差异。但荧光显微镜成像与生物量分析揭示：CF高糖条件下，直径≥5 μm的细菌聚集体数量及面积显著增加，该尺寸被认定为CF患者气道中典型细菌聚集尺度。2DG处理使聚集程度恢复至正常糖水平。表明高糖特异性地促进CF背景下S. aureus生物膜样结构形成。

高糖显著增强抗生素耐药性

在感染6小时后添加利福平（RIF，35 μg/mL）处理24小时，非CF细胞中RIF均有效杀菌；CF正常糖组中RIF亦可使菌落数降至检测限以下。然而在CF高糖条件下，RIF完全丧失杀菌效果，菌负荷与未处理组无差异。进一步研究发现，高糖条件下RIF耐药菌比例显著上升（非CF与CF细胞中趋势一致），而2DG处理可使耐药率回落至正常水平。值得注意的是，耐药菌仅在抗生素压力下选择产生，初始接种物及6小时样本中均未检测到预存耐药突变。

体外培养中高糖未诱导同等耐药

为排除宿主细胞影响，研究在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）和合成CF培养基（SCFM）中测试葡萄糖对S. aureus的直接作用。即便提高葡萄糖至10 mM，RIF仍能有效抑制细菌生长；若先培养6小时形成生物膜再加RIF，高糖组因初始菌量较高而表现出表观耐药，但归一化处理后杀菌效率无组间差异。补充外源葡萄糖不能重现ALI模型中的耐药水平，证实宿主微环境在高糖诱导耐药中起到关键作用。2DG在体外同样增强RIF杀菌效果，且不影响细菌正常生长。

讨论

本研究建立的ALI高糖模型成功模拟CFRD患者气道葡萄糖升高环境，并首次揭示高糖通过促进S. aureus聚集及抗生素耐药性双重机制加剧感染严重性。此效应依赖于宿主细胞存在，提示葡萄糖可能通过改变上皮细胞代谢或表面特性影响细菌行为。2DG作为葡萄糖竞争性抑制剂，可有效逆转高糖的不利效应，为辅助抗生素治疗提供了潜在代谢干预手段。未来研究需拓展至原代细胞、免疫细胞共培养及多元微生物环境，并探索高效CFTR调节剂（HEMT）对气道葡萄糖稳态的影响。

材料与方法

菌株为USA100 MRSA，携带GFP质粒pCM29用于成像。ALI细胞培养使用MEM培养基，葡萄糖浓度按实验设计调整。ASL葡萄糖采用Abcam试剂盒测定。感染实验以1×10⁶ CFU接种，Triton X-100裂解后铺板计数。荧光成像经4%多聚甲醛固定，Hoechst染色，NIS-Elements软件分析聚集面积。RNA提取后采用TaqMan探针进行RT-qPCR，细胞因子蛋白水平通过ELISA测定。统计采用GraphPad Prism进行ANOVA与Tukey检验。