铜绿假单胞菌甘油调节子激活：抗生素敏感性降低与慢性肺部感染的新机制

　　本研究揭示了囊性纤维化（CF）气道中铜绿假单胞菌通过激活甘油（glp）调节子（涉及glpF、glpK、glpD等基因）调控毒力表型并降低抗生素敏感性的新机制。GlpR缺失突变体在合成痰液、上皮细胞及果蝇模型中均表现出对妥布霉素（Tobramycin）耐药性增强，同时伴随藻酸盐（Alginate）过量产生及绿脓菌素（Pyocyanin）下调。该发现阐明了宿主源性甘油代谢在细菌持久性定植中的关键作用，为CF感染治疗提供了新靶点。

　　

引言：慢性感染的代谢适应策略

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）患者肺部慢性感染的主要病原体。其成功定植依赖于对宿主营养环境的代谢适应，尤其是利用气道中丰富的甘油。甘油代谢由glp调节子控制，包括甘油扩散促进蛋白GlpF、甘油激酶GlpK、甘油-3-磷酸脱氢酶GlpD等基因，这些基因受转录抑制子GlpR的负调控。前期研究发现，GlpR缺失会增强CF适应株FRD1的生物膜形成能力，而生物膜与抗生素耐药性密切相关。本研究旨在探究GlpR是否通过调节甘油代谢途径影响铜绿假单胞菌的抗生素敏感性及毒力表型。

GlpR缺失降低妥布霉素敏感性

通过最小抑菌浓度（MIC）测定，发现glpR缺失突变体（ΔglpR）在PAO1（伤口分离株）和FRD1（CF适应株）中均对氨基糖苷类抗生素妥布霉素的敏感性显著降低，但对头孢他啶（Ceftazidime）和环丙沙星（Ciprofloxacin）无显著影响。进一步研究表明，FRD1 ΔglpR对其他氨基糖苷类（如阿米卡星Amikacin）也表现出耐药性增强，而PAO1 ΔglpR未见类似现象。这表明甘油调节子的激活在CF适应株中特异性促进了抗生素耐受。

CF相关模型中耐药表型的验证

在模拟CF肺部营养环境的合成痰液培养基（SCFM2）中，FRD1 ΔglpR在10 μg/mL妥布霉素存在下仍能显著生长，而野生株生长受抑制。此外，利用人气道上皮细胞（16HBEs和CFBEs）及黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感染模型，发现FRD1 ΔglpR在妥布霉素处理后细菌载量显著高于野生型，且细胞毒性无差异。这些结果证实了GlpR依赖的耐药表型在宿主相关环境中的保守性。

转录组学揭示耐药相关基因调控

RNA测序分析显示，FRD1 ΔglpR在妥布霉素处理后特异性上调多种耐药相关基因，包括多重耐药外排泵组件MexA、钙稳态蛋白CarO以及推测的多药转运蛋白PA5159。其中，CarO的过表达与细胞内钙离子浓度降低相关。通过钙螯合剂EGTA处理，进一步证实钙稳态紊乱可增强FRD1 ΔglpR的妥布霉素耐药性。这些发现提示GlpR可能通过调节钙信号与外排泵系统影响抗生素敏感性。

毒力表型的双向调节

GlpR缺失对毒力因子的调节具有菌株特异性：在FRD1中，ΔglpR突变导致绿脓菌素（Pyocyanin）产量下降而藻酸盐（Alginate）产量上升，后者是慢性感染中黏液表型的标志；相反，PAO1 ΔglpR的绿脓菌素产量增加。转录组数据进一步显示，FRD1 ΔglpR中藻酸盐合成基因（algD、algF）表达上调，而PAO1 ΔglpR中吩嗪合成基因（phzC1、phzE1、phzG1）表达增强。这表明甘油代谢可双向调节急慢性感染相关毒力因子。

讨论：甘油代谢在慢性感染中的核心作用

本研究阐明GlpR介导的甘油代谢重编程是铜绿假单胞菌适应CF气道环境的关键机制。其通过促进生物膜基质（如Pel和藻酸盐）的产生、调控多重耐药基因表达以及改变细胞内离子稳态，共同贡献于抗生素耐药性和持久性感染。尽管CFTR调节剂疗法（HEMT）已改善CF患者预后，铜绿假单胞菌的持续存在提示靶向甘油代谢途径可能成为清除慢性感染的新策略。

材料与方法

研究使用PAO1和FRD1菌株及其ΔglpR突变体与回补株。抗生素敏感性通过MIC测定、生长曲线及体内外模型（上皮细胞、果蝇）评估。转录组学分析采用RNA-Seq技术，毒力因子（藻酸盐、绿脓菌素）通过生化法定量，钙浓度使用商业试剂盒检测。统计分析采用ANOVA或t检验，实验均包含至少三次生物学重复。