细菌浓度调整法快速直接纸片扩散检测尿路感染的抗生素耐药性

　　本综述推荐一种创新的快速直接纸片扩散法（DST），通过整合细菌浓度分析，无需标准化菌悬液制备，即可实现尿路感染（UTI）的抗生素药敏测试（AST）。该方法利用阈值调整或回归模型，将抑菌圈大小与浓度关联，显著缩短诊断时间18–24小时，且在临床样本中与标准AST的一致性高达93%以上，为资源有限地区提供了高效、可靠的诊断替代方案。

　　

引言

尿路感染（UTI）是全球最常见的细菌感染之一，年发病数约4亿例。其诊断通常依赖临床症状、试纸条测试和实验室培养，而抗生素药敏测试（AST）则需标准化菌悬液。传统纸片扩散法要求先将尿液样本孵育过夜，分离细菌并调整至0.5麦氏单位（McFarland）浓度，再接种于琼脂平板并放置抗生素纸片，通过测量18–24小时后的抑菌圈直径，与临床和实验室标准协会（CLSI）或欧洲抗菌药敏测试委员会（EUCAST）的折点表对比判断耐药性。这一流程耗时长达36–48小时，且资源需求较高。

直接药敏测试（DST）可直接从患者样本（如尿液）中快速获得表型药敏结果，无需病原体分离和传代培养，节省时间并减少表型变异风险。既往研究显示DST与标准AST的一致性常超过90%，但其主要局限在于未系统考虑细菌浓度的影响——即“接种量效应”（inoculum effect）。该效应表现为细菌浓度升高时抑菌圈缩小或最小抑菌浓度（MIC）增加，可能导致误判：低浓度耐药菌被误为敏感，高浓度敏感菌被误为耐药。尽管UTI的细菌浓度阈值常设为10³ CFU/mL，但既往DST方法多在单一任意浓度下测试，缺乏浓度调整的标准化解读。

本研究旨在评估两种新型快速纸片扩散法，通过将细菌浓度纳入分析，消除标准化菌悬液的需求，优化UTI的诊断流程与准确性。

结果

接种量对抑菌圈直径的影响

通过测试27例临床尿液分离菌在磷酸盐缓冲液（PBS）中不同浓度（0.5 McFarland、10⁵ CFU/mL和10³ CFU/mL）的悬液，并测量其对磷霉素、呋喃妥因和美西林等抗生素的抑菌圈，发现细菌稀释度增加时抑菌圈显著扩大（P <0.001）。Spearman等级相关系数显示，各浓度间抑菌圈变化趋势一致（r_S 0.81–0.95，P <0.001），证实浓度与抑菌圈大小存在直接关联。

若仅凭抑菌圈直径判断而不考虑浓度，敏感菌检出准确率达100%，但耐药菌仅64.7%被正确分类，误判遍布所有测试抗生素。尤其在稀释悬液中，敏感与耐药菌的抑菌圈出现重叠，凸显单纯依赖 halo 尺寸的局限性。

阈值调整法区分耐药性并整合细菌浓度

基于8株参考菌株的数据，建立了针对10⁵ CFU/mL和10³ CFU/mL浓度的新阈值折点，用于区分敏感与耐药菌。将此标准应用于临床分离菌后，敏感菌分类一致率达94.7%，耐药菌达94.1%。各抗生素在不同浓度下的具体一致率如下：磷霉素在10³ CFU/mL时敏感菌90.9%、耐药菌75%；呋喃妥因均达100%；美西林在10⁵ CFU/mL时敏感菌72.2%、耐药菌100%。参考菌株测试中，97.6%敏感菌和96.3%耐药菌被正确识别。

将临床尿液样本直接接种琼脂平板并采用阈值调整DST法，与标准纸片扩散法相比，真实敏感符合率93.7%，真实耐药符合率94.1%。误判样本包括4例假耐药和1例粪肠球菌（Enterococcus faecalis）对磷霉素假敏感。

回归法基于抑菌圈预测耐药谱

通过线性回归模型，将稀释悬液（10⁵ CFU/mL和10³ CFU/mL）的抑菌圈尺寸预测为标准0.5 McFarland对应的值，再与CLSI折点对比。模型基于参考菌株建立，并在临床样本中验证。

整体上，回归模型对敏感菌的预测准确率100%，耐药菌88.2%。各抗生素在10⁵ CFU/mL浓度下平均绝对误差（MAE）较低（1.72–2.34 mm），预测更准确；10³ CFU/mL时误差增大（2.59–3.47 mm）。具体地，磷霉素在10³ CFU/mL时耐药菌一致率75%；呋喃妥因均100%；美西林在10⁵ CFU/mL时耐药菌88.9%，10³ CFU/mL时降至55.6%。

直接测试临床尿液样本时，回归法的敏感与耐药符合率均为93.7%和94.1%，误判情况与阈值法一致。

讨论

本研究开发的两种浓度调整DST法显著优化了UTI的AST流程，省去菌悬液标准化步骤，将诊断时间缩短18–24小时，且与标准方法高度一致。它们尤其适合资源有限地区，因成本低、操作简，能促进靶向治疗并改善患者预后。

浓度效应在AST中的关键作用得到强化：考虑细菌浓度后，耐药判读一致率从64.7%提升至94.1%（阈值法）或88.2%（回归法）。直接尿液应用进一步证明该方法在真实场景中的可靠性，且回归法更易整合现有标准流程，因它无需新折点而直接采用CLSI/EUCAST表。

然而，低浓度下抑菌圈边缘模糊（如变形杆菌蔓延生长）可能影响读数，导致与标准AST差异。此外，DST应仅用于未经抗生素预处理的患者尿液，以免微生物组成改变导致偏差。

未来需扩展验证更多病原体和浓度范围，优化折点与模型，并探索自动化整合以提升方法普适性。总体而言，这些浓度感知的DST法为推动快速、临床可靠的尿路感染诊断提供了实用进步。

材料与方法

使用菌株包括大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 13883等8株参考菌及临床尿液分离株。抗生素纸片为磷霉素200 μg（含G6P 50 μg）、呋喃妥因100 μg和美西林10 μg。实验用LB琼脂和Mueller-Hinton琼脂，孵育均37°C、18小时。

参考数据库通过测量参考菌在0.5 McFarland、10⁵ CFU/mL和10³ CFU/mL悬液的抑菌圈建立，敏感/耐药按CLSI标准分类。临床尿液样本取自疑似UTI患者，经MALDI-TOF鉴定物种，入选标准为单菌感染（肠杆菌、葡萄球菌等）、浓度≥10³ CFU/mL且无抗生素预处理。

抑菌圈测量时，高浓度（10⁵ CFU/mL）测两对向菌落距离，低浓度（10³ CFU/mL）量至最近菌落边缘距并加倍。折点应用CLSI表，无标准时间 extrapolate 或依无抑菌圈判耐药。

阈值优化算法基于参考菌数据最大化分类准确率，回归模型用线性拟合（Halo_0.5McF = a + b × Halo_dilution）。统计采用Shapiro-Wilk正态检验、Kruskal-Wallis和Mann-Whitney U非参数测试及Spearman相关，显著性设P <0.05。