TAK1磷酸化介导Macozinone（PBTZ169）通过激活先天免疫对抗结核病的新机制

　　本研究发现抗结核候选新药Macozinone（PBTZ169）除直接抑制结核分枝杆菌（Mtb）细胞壁合成外，还能通过激活TAK1磷酸化，显著增强NF-κB和MAPK信号通路，促进巨噬细胞产生炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α等）和I型干扰素（IFNα/β），从而增强宿主对耐药结核的清除能力。这一发现为结核病治疗策略提供了新的免疫调节视角。

　　

ABSTRACT

结核病（TB）特别是耐药结核的治疗面临持续临床挑战，当前药物研发主要关注病原体特异性靶点而忽视药物对宿主免疫的影响。本研究通过评估重要抗结核药物对宿主先天免疫的作用，发现PBTZ169具有强效先天免疫激活功能。在脂多糖（LPS）刺激和PBTZ169耐药菌感染条件下，PBTZ169显著上调细胞因子和I型干扰素表达，并通过激活TAK1磷酸化上调NF-κB和MAPK信号通路。TAK1敲除实验证实该机制是PBTZ169介导免疫激活和抗菌效应的关键。

INTRODUCTION

结核病由结核分枝杆菌（Mtb）引起，2023年重新成为全球单一传染病首要死因。目前治疗方案存在疗程长、副作用大等问题，且忽视药物免疫调节特性。宿主免疫稳态对病原清除和组织修复至关重要，但过度免疫激活可能导致细胞因子风暴（CRS）等组织损伤。不同抗生素展现不同免疫调节活性，如利福平具有免疫抑制效应，而吡嗪酰胺通过PPAR和NF-κB途径调节免疫。PBTZ169作为苯并噻唑酮类衍生物，通过靶向DprE1酶抑制细菌细胞壁合成，但其对宿主免疫的影响尚未明确。

RESULTS

PBTZ169促进先天免疫信号通路激活

通过NF-κB和MAPK双荧光素酶报告系统筛选发现，PBTZ169处理组荧光强度显著高于异烟肼（INH）、利福平（RFP）等对照组。在人肺泡巨噬细胞（HAMs）感染模型中，PBTZ169剂量依赖性上调IL-6、IL-12p40、IL-1β和TNF-α mRNA表达。

PBTZ169增强细胞因子和I型干扰素表达

LPS刺激的THP-1细胞经PBTZ169处理后，IL-1β、IL-6、IL-12p40、IL-12p35、TNF-α、IFN-α和IFN-β表达显著上调，且呈浓度依赖性。在PBTZ169耐药菌感染模型中，持续给药5天仍能维持细胞因子增强效应。

PBTZ169免疫增强活性强化细胞内杀菌效能

感染PBTZ169r-Mtb的J774A.1巨噬细胞经药物处理后，细胞内菌落形成单位（CFU）显著降低。干扰素受体IFNAR1敲除后，PBTZ169的抗菌效果进一步增强。

RNA深度测序揭示PBTZ169对先天免疫的激活作用

RNA测序显示0.2μg/mL和0.4μg/mL PBTZ169分别产生453和564个差异表达基因（DEGs）。GO、KEGG和Reactome分析表明这些基因显著富集于白细胞迁移、吞噬作用、溶酶体功能、趋化因子信号和干扰素信号等先天免疫相关通路。

PBTZ169激活NF-κB和MAPK信号通路

Western blot分析显示PBTZ169显著增加p65、p38和JNK磷酸化水平。NF-κB/AP-1抑制剂HY-133987可完全阻断PBTZ169对细胞因子的上调作用，证实其免疫激活效应依赖NF-κB/MAPK通路。

PBTZ169免疫激活效应依赖TAK1

荧光素酶实验表明PBTZ169通过MyD88、IRAK4、TRAF6、TAK1和TAB2增强NF-κB激活。磷酸化检测显示PBTZ169显著提升TAK1（Thr184/187）磷酸化水平。TAK1敲除后，PBTZ169的抗菌效应明显减弱，证实TAK1是其免疫激活的关键介质。

DISCUSSION

PBTZ169作为临床二期抗结核新药，本研究首次揭示其通过TAK1磷酸化激活宿主先天免疫的新机制。该发现对优化结核治疗策略具有重要意义：免疫增强特性可能适用于感染早期建立防御免疫，但需警惕细胞因子风暴风险。药物选择需结合患者免疫状态和治疗阶段个体化调整，这一理念仍需更多临床研究验证。

MATERIALS AND METHODS

细胞系和菌株

使用HEK293T、J774A.1、THP-1细胞系和人原代肺泡巨噬细胞。结核菌株包括H37Rv标准株和临床分离PBTZ169耐药株（PBTZ169r-Mtb）。

药物、质粒和抗体

常规抗结核药物购自Sigma-Aldrich，PBTZ169和BDQ购自Biochempartner。信号通路质粒由中国科学院微生物研究所馈赠，TAK1等相关质粒由实验室自行构建。抗体购自Cell Signaling Technology和Servicebio。

荧光素酶报告实验

采用双荧光素酶报告系统检测NF-κB和MAPK通路活性。转染相应报告质粒后，分别用TNF-α（NF-κB通路）、RacL61（JNK通路）或RasV12（ERK通路）激活通路并检测荧光强度。

RNA测序

感染PBTZ169r-Mtb的J774A.1细胞经药物处理24小时后提取RNA，Novogene公司完成测序和生物信息学分析。

RT-qPCR和Western blot

TRIzol法提取RNA，SYBR Green法进行qPCR检测。RIPA裂解液提取蛋白，Western blot检测信号通路蛋白及其磷酸化水平。

细胞内Mtb复制实验

巨噬细胞感染Mtb后去除胞外菌，药物处理指定时间后裂解细胞，涂布7H10琼脂培养3-4周进行CFU计数。

统计分析

GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，多组比较采用单因素或双因素方差分析，两组比较采用t检验。