中国blaNDM-1阳性奇异变形杆菌的全球系统发育地理学与基因组特征研究

　　本综述深入探讨了中国blaNDM-1阳性碳青霉烯耐药奇异变形杆菌（CRPM）的传播机制与流行病学特征，揭示了质粒和沙门菌基因组岛1（SGI1）介导的传播途径，以及插入序列ISCR1驱动的耐药基因扩增现象，为临床耐药防控提供了重要分子依据。

　　

ABSTRACT

碳青霉烯耐药奇异变形杆菌（CRPM）在全球范围内构成日益严重的威胁，其主要由bla_NDM-1基因的传播所驱动。本研究通过药敏试验、接合实验、全基因组测序和生长实验，分析了2017-2024年间从中国某三甲医院分离的16株bla_NDM-1阳性CRPM临床分离株。研究发现bla_NDM-1的传播主要通过质粒和沙门菌基因组岛1（SGI1）实现，其中包括一个新发现的SGI1-PM16变体。早期传播事件与Tn125衍生元件（ΔTn125）相关，而ISCR1似乎介导了滚环转座，可能促进了耐药盒的局部扩增。此外，研究还从NCBI数据库（截至2025年4月21日）中整理了420个bla_NDM阳性CRPM基因组，进行了全球基因组流行病学研究。ST135成为中国CRPM中的优势克隆。全球奇异变形杆菌的系统发育地理学分析阐明了NDM变异体的地理流行特征：美国以bla_NDM-7为主，而中国则以bla_NDM-1最为常见。总之，本研究为CRPM的耐药机制和传播动态提供了重要见解，并强调需要加强基因组监测和优化感染控制策略以遏制bla_NDM-1阳性CRPM的传播。

INTRODUCTION

随着多重耐药（MDR）细菌的流行，碳青霉烯类药物通常成为治疗严重革兰阴性菌感染的最后手段。长期或不适当的抗生素使用促进了能够水解碳青霉烯类的碳青霉烯酶产生菌株的出现。基于对碳青霉烯耐药肠杆菌目（CRE）全球传播的分析，KPC和NDM是全球主要的碳青霉烯酶。一项多中心研究表明，携带bla_NDM的CRE感染患者的30天死亡率显著升高，达到29.7%，这对革兰阴性菌感染的临床管理构成了重大挑战。

NDM是一种B类金属β-内酰胺酶，对除单环酰胺类外的大多数β-内酰胺类药物产生耐药。bla_NDM基因的全球传播是一个重大的公共卫生问题；该基因可通过可移动DNA载体（如接合质粒、整合接合元件和移动遗传元件（MGEs））在不同物种间水平传播。耐药基因的传播主要归因于质粒的水平转移，但有些遗传结构可通过 mobilization 方式传播，沙门菌基因组岛1（SGI1）就是如此，它包含一个保守骨架和一个多药耐药区域，其中各种抗生素耐药基因（ARGs）聚集在一个复杂的1类整合子中。最近，SGI1及其衍生物在奇异变形杆菌中被广泛报道。

奇异变形杆菌是一种革兰阴性肠杆菌，经常引起医疗保健相关的尿路感染，特别是在长期使用导管的情况下。碳青霉烯酶的出现令人担忧，因为奇异变形杆菌本质上对多粘菌素和替加环素耐药。本研究对2017年至2024年间从中国一家三甲医院收集的bla_NDM-1阳性碳青霉烯耐药奇异变形杆菌（CRPM）临床分离株进行了全面的分子和基因组流行病学分析，并调查了全球范围内NDM阳性CRPM的系统发育关系、地理分布和种群动态。

RESULTS

Characteristics of the CRPM strains

2017年1月至2024年9月期间，从杭州一家三甲医院共收集了170株多重耐药（MDR）奇异变形杆菌临床分离株。分子筛查从该收集中鉴定出55株bla_KPC产生株和16株bla_NDM-1阳性CRPM分离株。其余菌株对所有已知的碳青霉烯耐药相关基因检测均为阴性。本研究主要关注16株bla_NDM-1阳性CRPM分离株的基因组特征。这些分离株来自年龄在14至96岁之间的患者。大多数分离株来自粪便（31.3%，5/16）、痰液（25.0%，4/16）和尿液（25.0%，4/16），其余分离株来自血液、腹水和咽拭子（各6.3%，1/16）。除PM33和PM54来自同一患者外，所有分离株均来自不同患者。PM33和PM54虽源自同一患者，但标本采集时间相隔两个多月。所有分离株均携带bla_NDM-1。

药敏试验（AST）显示，所有bla_NDM-1阳性CRPM均对美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢他啶、头孢他啶-阿维巴坦、头孢吡肟和环丙沙星耐药，对头孢地尔和阿兹特隆-阿维巴坦敏感。相比之下，只有37.5%的菌株（n = 6）对阿米卡星耐药，8株对阿米卡星敏感，2株为中介。

Genomic characteristics of CRPM strains harboring bla_NDM-1

所有16株CRPM分离株的全基因组测序（WGS）分析显示，染色体大小保守（约4 Mb），质粒含量可变（每个分离株0-3个质粒）。为了阐明NDM产生CRPM之间的系统发育关系和基因组流行病学，使用多位点序列分型（MLST）和核心基因组系统发育分析进行了高分辨率分子表征。系统发育重建将NDM-1产生分离株分为六个不同的进化枝，对应六个序列类型（STs）：ST135（44%，n = 7/16）、ST204（19%，n = 3/16）、ST185（19%，n = 3/16）、ST218（6%，n = 1/16）、ST330（6%，n = 1/16）和ST269（6%，n = 1/16）。SNP鉴定显示，三个分离株（PM32、PM33和PM54）高度同源（成对核心基因组SNP距离<13），表明存在克隆传播。核心基因组系统发育进一步证明ST135内的七个分离株存在克隆聚集，表明存在密切相关的基因组谱系。相比之下，其余九个分离株表现出广泛的遗传多样性，分布在五个不同的STs（ST185、ST204、ST218、ST330和ST269）中，表明NDM-1在这些菌株中存在多克隆传播。

WGS在16个分离株中鉴定出覆盖9种抗生素类别的30种不同的抗菌素耐药基因（ARGs）。这些包括β-内酰胺类（bla_NDM-1, bla_CTX-M-14, bla_CTX-M-65, bla_TEM-1, bla_OXA-10, bla_OXA-1）、氯霉素类（catA1, catA4, catB3, catB8, floR）、氨基糖苷类[aph(3')-Ia, aph(3'')-Ib, aph(4)-Ia, aph(6)-Id, aac(3)-IId, aac(3)-IVa_1, ant(2'')-Ia]、四环素类[tet(B), tet(C), tet(J), tet(Z)]、磺胺类（sul1, sul2）、磷霉素（fosA3）、大环内酯类[ere(A), mph(E)]、氟喹诺酮类[aac(6')-Ib-cr_1]、林可酰胺类[lnu(F), lnu(G)]和利福霉素类（arr-3）。在四个分离株中，bla_NDM-1位于染色体上的SGI1内。相比之下，其余分离株的bla_NDM-1基因位于IncN（n = 2）、pPrY2001样质粒（n = 6）和pPM54-NDM_252k样质粒（n = 3）上。值得注意的是，PM8086在染色体（SGI1）和pPrY2001样质粒上都携带bla_NDM-1。此外，在大多数分离株中bla_NDM-1为单拷贝，但PM32例外，其在SGI上有一个额外的bla_NDM-1拷贝。

Plasmid analysis and genetic structure

获得了携带bla_NDM-1的IncN质粒（pPM1700-NDM_54k）、pPrY2001样质粒（pPM14-NDM_123k, pPM22-NDM_109k, pPM8086-NDM_156k, pPM65-NDM_124k, pPM8747-1）和pPM54-NDM_252k样质粒（pPM33-NDM_252k, pPM54-NDM_252k）的完整序列。在其余四个分离株（PM3393, PM8747, PM4060, PM34）中，质粒contig与本研究中使用纳米孔测序解析的三种bla_NDM-1携带质粒高度相似。所有测试的质粒，除了pPM54-NDM_252k样类型外，均成功接合到大肠杆菌J53中。AST结果显示，携带NDM-1的大肠杆菌接合子对碳青霉烯类（美罗培南、亚胺培南、厄他培南）、头孢菌素类（头孢他啶、头孢吡肟）和β-内酰胺酶抑制剂（头孢他啶-阿维巴坦）的MIC值升高。

pPrY2001样质粒的基因组结构由两个主要区域组成：骨架和辅助模块。对pPrY2001样质粒骨架的成对比较显示，在其长度超过66%的区域内核苷酸同一性>97%，表明骨架是保守的。随后，pPM54-NDM_252k样质粒与在中国临床分离株中发现的几种质粒显示出显著相似性，包括摩根摩根菌MM9291-NDM-1_257k和华西普罗威登斯菌pPH1503-1-NDM。值得注意的是，pPM54-NDM_252k和MM9291-NDM-1_257k分离自中国相同的三甲医院，表明bla_NDM-1可能在不同物种间传播。IncN质粒pPM1700-NDM_54k与弗氏柠檬酸杆菌pNDM-Cf7308和大肠杆菌pZ30-NDM-29（均分离自中国）显示出99.99%的同一性和100%的覆盖度，高度相似。

携带bla_NDM-1的ΔTn125转座子通常位于1类整合子的第二个可变区。Tn125的结构是ISAba125-bla_NDM-1-ble_MBL-trpF-dsbD-cutA-groES-groEL-ISCR21-oriIS-ISAba125，最初从罗伊氏不动杆菌中获得。本研究中pPrY2001样质粒的ΔTn125大致可分为三种类型。与Tn125相比，pPrY2001和pPM22-NDM_109k的ΔTn125缺少ISCR27下游的ISAba125。此外，来自这两个质粒的ΔTn125存在以下差异：pPM22-NDM_109k中ΔTn125上游的ISAba125被截断，这可能是由于IS26插入到ΔISAba125的上游。另一种类型的ΔTn125，结构为ISAba125-bla_NDM-1-ble_MBL-trpF-ΔdsbD，存在于pHFK418-NDM、pPM65-NDM_124k和pPM14-NDM_123k中。值得注意的是，位于pPM8086-NDM_156k质粒中的III型ΔTn125完全缺失了dsbD，并且上游的ISAba125和trpF被截断。

Tn125的衍生物也存在于pPM54-NDM_252k样质粒中，结构为bla_NDM-ble_MBL-trpF-ΔdsbD。整合子In251位于pPM54-NDM_252k样质粒中ΔTn125的上游，包含多个耐药基因，包括aadB、catB8、bla_OXA-10、aadA1、dfrA1和aacA4。这些发现表明，Tn125衍生的复合转座子是促进bla_NDM-1传播的普遍载体。这些移动结构可能促进克隆的出现和传播。

pPM1700-NDM_54k（IncN质粒）中bla_NDM-1基因的遗传环境是ISKpn19-ΔTn125（ΔISAba125-bla_NDM-1-ble-trpF-dsbD-cutA-groES）-ISKpn19，其中bla_NDM-1基因位于一个截短的ISAba125元件下游，该元件为bla_NDM-1提供了启动子的-35区。这种遗传环境也在大肠杆菌pHKN-2质粒、肺炎克雷伯菌unnamed 2质粒和科泽柠檬酸杆菌pL2395_NDM质粒中被发现。与pPM1700-NDM_54k不同，pHKN-2和unnamed 2在其ΔTn125内拥有完整的groES和groL，而groES在pL2395_NDM中完全缺失。

SGI1 characterization

SGI1是一个位点特异性整合的可移动元件，最初在鼠伤寒沙门菌中被鉴定。SGI1包含一个约27.4 kb的骨架，包含28个ORF，从intSGI1（S001）到resG（S027）加上S044。大多数SGI1变体在int1上有所不同；然而，SGI1-HLK组在骨架上显示出特征性的改变。序列分析显示，四个奇异变形杆菌分离株（PM16、PM23、PM32和PM8086）的SGI1整合在染色体基因thdF和hipB之间。这些SGI1元件分为三种结构类型。

比较基因组分析表明，PM23-SGI1和PM8086-SGI1与SGI1-1NDM具有绝对的核苷酸序列同源性（100%同一性），PM32-SGI1同样与SGI1-2NDM显示出完美的序列保守性。这两种类型的SGI1最初是在源自中国的临床奇异变形杆菌菌株中报道的。SGI1-1NDM的多药耐药（MDR）区域具有一个复杂的1类整合子结构（InSGI1-1NDM），其组织为5'CS（intI1）、VR1（dfrA12-orfF-aadA2）、3'CS-1（qacEΔ1/sul1）、ISCR1、VR2（trpF-ble_MBL-bla_NDM-1-catB3-arr-3）和3'CS-2（qacEΔ1/sul1）。与InSGI1-1NDM相比，InSGI1-2NDM携带两个VR2区域，含有bla_NDM-1，以及相邻的ISCR1和3'CS。先前的工作表明，携带两个bla_NDM-1拷贝的SGI1-2NDM变体比单拷贝变体表现出更高的碳青霉烯MIC值和增加的bla_NDM-1表达水平，与单拷贝变体相比，bla_NDM-1表达水平提高了2.1倍。

与现有SGI1的进一步比较表明，PM16拥有一个新颖的SGI1结构，命名为SGI1-PM16。SGI1-PM16显示出SGI1-HKL组骨架特征，包括一个IS1359元件，其一端位于traN内，这与SGI1-HKL组一致。SGI1-PM16的MDR区域包含一个1类整合子（InSGI1-PM16），由5'CS、VR1、3'CS-1、ISCR1、VR2和3'CS-2组成。VR2结构与上述InSGI1-1NDM相同，而VR1区域与先前报道的整合子B匹配，结构为aac(6’)-lb-cr5 -arr-3-dfrA27-aadA16。这些发现表明，SGI1及其变体在奇异变形杆菌中bla_NDM-1的出现和快速传播中起着关键作用。

ISCR1 circular intermediates

ISCR1可以产生IS91样环状中间体，通过oriIS和terIS进行滚环转座。全基因组测序显示，PM7752的基因组包含一个6,400 bp的环状片段，其结构与InSGI1-1NDM的3'CS-1（qacEΔ1/sul1）、ISCR1和VR2（trpF-ble_MBL-bla_NDM-1-catB3-arr-3）区域相同。为了进一步验证该序列的环状性质，使用了跨越连接处的引物（YZ-F: AAGACATAATTGCTCACAG, YZ-R: ATGATCTAACCCTCGGTCTC）进行PCR检测，扩增子大小分析证实了其环状构型。这些数据表明，bla_NDM-1可以通过ISCR1介导的环状中间体进行移动，这些中间体组装到1类整合子环境中，从而促进bla_NDM-1的进一步传播。

Fitness effects

为了评估携带bla_NDM-1质粒相关的适应性成本，我们在大肠杆菌J53受体菌株与接合子JPM1700_NDM和JPM65_NDM之间进行了无抗生素条件下的比较生长曲线分析。定量分析显示，与亲本J53菌株相比，两个NDM-1产生接合子均表现出显著受损的生长动力学（减少7.0%–12.2%，P < 0.0001），且最终生物量（OD600）较低。使用曲线下面积（AUC）进一步评估生长能力，显示JPM1700_NDM的AUC比J53低约26.8%（956.2 ± 23.2 vs 1296 ± 10, P < 0.001），JPM1700_NDM通过AUC显示出显著的适应性降低，而尽管存在轻微的速率/OD600差异，JPM65_NDM的AUC与J53没有显著差异。这些发现表明，携带编码bla_NDM-1的IncN型质粒或pPrY2001样质粒都会对宿主细菌施加可测量的适应性负担。

Global phylogeography and phylogeny

为了研究NDM产生CRPM的系统发育地理关系，从本研究和NCBI数据库（截至2025年4月21日）获得了420个分离株的基本信息。大多数NDM产生CRPM来自北美（48.6%，204/420），其次是亚洲（29.5%，124/420）、欧洲（9.8%，41/420）、非洲（5.2%，22/420）和其他地区（6.9%，29/420）；提交数量随时间增加。NDM产生CRPM已在全球29个国家报道，大多数分离株在美国检测到（47.86%，201/420），其次是中国（25.95%，109/420）和德国（4.52%，19/420）。

在bla_NDM变体中，bla_NDM-1（69.1%，290/420）和bla_NDM-7（22.6%，95/420）占主导地位（合计>85%）。大多数NDM-1产生CRPM来自中国（33.45%，97/290）、美国（32.07%，93/290）和欧洲国家（13.1%，38/290）。值得注意的是，大多数NDM-7产生CRPM分布在美国（92.63%，88/95），在中国（5.26%，5/95）和欧洲国家（2.1%，2/95）只有少量分布。MLST分析显示，420个NDM产生CRPM可分为93个不同的STs。其中，七个STs占比超过3%，包括ST135、ST284、ST145、ST185、ST269、ST178和ST187。在分析的CRPM中，ST135成为优势序列类型，占收集菌株的14.05%（59/420），并在11个国家广泛分布。第二流行的谱系ST284占分离株的7.14%（30/420），仅限于中国和美国，紧随其后的是ST145，占5.95%（25/420），同样显示出仅限于这两个国家的双峰分布。值得注意的是，所有ST284分离株的CRPM都携带bla_NDM-7。

为了追踪本研究中携带bla_NDM-1的CRPM与全球其他NDM产生CRPM之间的系统发育关系，使用来自本研究