加拿大肉鸡源普通大肠杆菌的基因型多样性、致病型分布及耐药基因组特征研究

　　本研究通过全基因组测序(WGS)对加拿大六地区2732株肉鸡源普通大肠杆菌进行深入分析，揭示了其显著的遗传多样性（共376种血清型、236种序列型及21种致病型），并证实表型耐药性与基因型（AMR）高度一致(>85%)。研究发现β-内酰胺类、氟喹诺酮类和苯尼科尔类耐药基因多位于质粒(>95%)，且耐药基因携带量存在地域差异（魁北克省最高）。该研究强调了非致病性大肠杆菌作为临床重要耐药基因和毒力因子储存库的潜在风险。

　　

Abstract

大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于动物和人类体内，部分菌株具有致病能力。本研究对加拿大国家肉鸡微生物基线研究中从六个地区采集的2732株普通大肠杆菌分离株进行了比较基因组分析。所有分离株均进行了全基因组测序，其中1122株测试了对15种抗菌药物的表型耐药性。这些分离株表现出高度多样性，共鉴定出376种血清型、236种序列型（STs）和21种致病型（包括19种杂交致病型）。在15种抗菌药物中，有13种表现出表型耐药性与耐药基因及点突变（耐药决定簇）存在高度一致性（>85%）。超过95%的β-内酰胺类、氟喹诺酮类和酚类耐药基因被预测为质粒携带。魁北克省分离株的每个基因组中耐药决定簇数量最高，而与β-内酰胺耐药相关的基因在卑诗省的分离株中更常见。加拿大禽类中的普通大肠杆菌具有高度多样性，可携带具有临床意义的致病型相关毒力因子和耐药决定簇，存在演变为致病菌株的风险。

Introduction

大肠杆菌是肠杆菌科成员，是动物和人类胃肠道的正常栖息菌。致病性大肠杆菌菌株因携带特定毒力因子和产生多种毒素，可引起人类多种疾病，包括腹泻性感染和肠外感染。大肠杆菌致病型根据感染部位和特定疾病进行区分，肠道致病型包括产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产志贺毒素大肠杆菌（STEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠集聚性大肠杆菌（EAEC）和弥散粘附性大肠杆菌（DAEC）。肠外感染大肠杆菌通常分为三种致病型：新生儿脑膜炎大肠杆菌（NMEC）、尿路致病性大肠杆菌（UPEC）和败血性大肠杆菌。在家禽中，能够引起严重呼吸道和全身性感染的强毒株被归类为禽致病性大肠杆菌（APEC）。某些APEC菌株可导致禽类大肠杆菌病和气囊炎，增加鸡只死亡率，给生产者带来经济损失。尽管这些致病型大多具有直接的临床相关性，但非致病性大肠杆菌在畜禽中广泛存在，并有可能将耐药基因和毒力因子转移给致病菌株或其他物种，然而非致病性大肠杆菌的研究仍然不足。

抗菌药物几十年来一直被用于畜禽生产中的疾病预防、治疗和生长促进。因此，肉鸡是抗菌药耐药（AMR）大肠杆菌的重要储存库，能够引起食源性疾病。禽类生产中使用抗菌药物导致耐药性增加，使得用于治疗感染的抗菌药物效果下降。抗菌药耐药性对人类和动物健康构成日益严重的威胁，世界卫生组织（WHO）最近宣布其为全球十大公共卫生威胁之一。2018年，AMR估计给加拿大医疗系统造成14亿加元的成本，并导致约5400人死亡。同样，美国疾病控制与预防中心估计，美国每年发生超过280万例抗生素耐药性感染，超过3.5万人因此死亡。各国政府和国际卫生组织日益关注这一威胁，因为它降低了预防和治疗动物及人类传染病的能力。

2022年，加拿大生产了13.4亿公斤鸡肉，其中61%产自安大略省和魁北克省。与许多工业化国家一样，禽肉是加拿大人消费最多的动物蛋白。2021年加拿大消费者人均禽肉消费量为35.8公斤，预计到2026年将增至37.0公斤。在肉鸡生产中，抗菌药物通常通过饲料给药，较少通过饮水给药，用于预防产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎和呼吸道疾病。2011年，加拿大鸡肉农场主制定了负责任抗菌药物使用战略，推广了减少抗菌药物使用的良好生产规范。此外，通过该倡议，加拿大禽类生产分别在2014年和2018年停止了I类（对人类医学极为重要）和II类（对人类医学高度重要）抗菌药物的预防性使用。截至2019年，只有IV类抗菌药物（重要性较低），即不用于人类医学的药物，可用于畜禽生长促进。

在2012-2013年国家肉鸡微生物基线研究（MBS）中，从屠宰场或零售点的肉鸡中分离出普通大肠杆菌，作为衡量屠宰场粪便污染的一种手段。该研究的目的是确定肉鸡产品上大肠杆菌的流行率和浓度。本研究旨在利用该大肠杆菌菌株集合的全基因组测序（WGS）来：（1）描述从加拿大各地家禽场回收的血清型、序列型（STs）和致病型；（2）表征抗菌药耐药决定簇和毒力因子；（3）评估基于WGS的AMR预测与表型确定的抗菌药物敏感性之间的一致性。

Materials and methods

Bacterial isolates

本分析中使用的所有大肠杆菌分离株均在2012年12月至2013年12月期间收集，作为加拿大食品检验局（CFIA）与行业和政府合作伙伴进行的国家MBS的一部分。大肠杆菌分离株取自加拿大六个地区的联邦注册禽类屠宰企业或零售点的肉鸡样本（全胴体、鸡腿和鸡胸）：阿尔伯塔省（n = 332）、大西洋省份（n = 250）、不列颠哥伦比亚省（n = 570）、中西部（n = 282）、安大略省（n = 488）和魁北克省（n = 810）。抗菌药敏感性测试如前所述进行。简而言之，随机选择1122株来自屠宰场肉鸡胴体的大肠杆菌分离株进行抗菌药敏感性测试，以估计加拿大不同地理区域的AMR水平。使用肉汤微量稀释法测试分离株对15种抗菌药物的表型敏感性：阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林、阿奇霉素、头孢西丁、头孢噻呋、头孢曲松、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸、链霉素、磺胺异噁唑、四环素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑。

Whole-genome sequencing and genome assembly

从在37°C脑心浸液肉汤（OXOID）或LB肉汤（ThermoFisher Scientific）中培养14-22小时的过夜肉汤培养物中提取基因组DNA（gDNA）。使用Promega Maxwell? 16细胞DNA纯化（SEV）试剂盒（Promega）或QIAGEN DNeasy Blood and Tissue 96试剂盒（QIAGEN）按照制造商的建议进行gDNA提取。使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒提取的样品用RNaseA处理，并在110 μL 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0中洗脱。使用Quant-iT?或Qubit? dsDNA Broad Range或High Sensitivity检测试剂盒（ThermoFisher Scientific）按照制造商的说明对双链gDNA进行定量。gDNA提取物或在现场进行测序，或分发到CFIA（渥太华、本拿比）或加拿大卫生部（隆格伊）的合作实验室，使用Illumina MiSeq和NextSeq平台进行测序。使用Nextera XT DNA样本制备试剂盒（Illumina）和Nextera XT索引试剂盒（Illumina），每株菌使用1 ng gDNA制备测序文库。使用600循环MiSeq试剂盒（V3）或300循环NextSeq 500/550 Mid Output Kit（v2.5）在Illumina MiSeq或NextSeq平台上进行双末端测序，目标覆盖度为40倍。原始基因组序列上传至温尼伯国家微生物实验室的集成快速传染病分析（IRIDA）平台，用于质量评估和数据存储。

使用IRIDA上的组装和注释流程对2732株大肠杆菌分离株的原始双末端读段进行组装。简而言之，使用Shovill v1.0.4组装Illumina双末端读段，同时使用QUAST计算每个基因组的基因组大小、GC含量和N₅₀值，并使用Prokka v1.14.6对组装的基因组进行注释。所有分离株的短读长WGS数据可在BioProject PRJNA966974下获取。

AMR determinant detection, typing and virulence factor identification

使用TORMES流程v1.3.0分析组装的基因组。在TORMES流程中，使用ResFinder v2.4.0和PointFinder v4.0.1来识别获得性抗生素耐药基因（ARGs）和点突变。使用综合抗生素耐药性数据库（CARD）确定是否存在与禽类生产中使用的抗菌药物（如杆菌肽和维吉尼亚霉素）相关的ARGs。随后使用MOB-suite v3.1.8将TORMES中使用ResFinder数据库检测到的ARGs鉴定为质粒或染色体来源。分别使用SerotypeFinder v1.0.0和mlst v2.19.0分配血清型和序列型（STs）。通过对毒力因子数据库（VFDB）进行BLASTN搜索来推断毒力因子的存在。耐药基因和毒力因子命中使用90%序列覆盖度和95%核酸序列一致性的截止值进行过滤。

许多用于定义大肠杆菌致病型的毒力基因不在TORMES流程部分的VFDB数据库中。因此，使用VirulenceFinder 2.0与ABRicate v1.0.1来识别致病型相关毒力基因。致病型毒力基因使用90%序列覆盖度和95%核酸序列一致性的截止值进行过滤。根据先前发表的报告，为EAEC、DAEC、EIEC、EPEC、EHEC、UPEC、NMEC、ETEC和APEC选择了致病型特异性毒力基因。

Concordance of susceptibility phenotypes with genotypes

一部分大肠杆菌分离株（1122/2732）进行了表型抗菌药敏感性测试，并用于评估耐药表型与耐药基因型之间的一致性。在此分析中，具有中间最低抑菌浓度（MIC）值的分离株被归类为敏感。通过识别表现出表型耐药（Pheno:R）和预期耐药基因型（Geno:R）的分离株，以及表型敏感（Pheno:S）且缺乏该抗菌药物的ARG或突变的分离株（Geno:S）来确定一致性。十五种抗菌药物中每一种的一致性计算如下：

[一致性计算公式]

由于mdf(A)基因由所有分离株携带，因此将其排除在一致性分析之外。

Data analysis

使用R v4.3.2进行数据操作和统计分析。使用卡方独立性检验评估地理区域间血清型、毒力基因和AMR决定簇分布的差异。排除包含少于10个分离株的血清型，以及具有未分型O抗原（n = 179）或H抗原（n = 7）的分离株。当卡方检验的假设被违反时，使用simulate.p.value = TRUE参数，基于2000次重复执行Pearson卡方检验与模拟p值。进行单因素方差分析和Tukey真实显著差异检验，以确定六个区域之间检测到的每个基因组的ARGs和突变平均数量是否存在显著差异（p < 0.05）。

Results

在2732株大肠杆菌分离株中，检测到属于九类抗菌药物的ARGs，其分布因地理位置而异。总共检测到63个耐药基因和10个与四个基因（folp、gyrA、parC和parE）相关的点突变。在点突变中，与氟喹诺酮耐药相关的gyrA基因S83L突变最为常见（181/2732；6.6%）。在所有地点检测到的耐药基因和突变中，氨基糖苷类耐药决定簇（包括18个耐药基因）是最常检测到的。最常检测到的ARGs包括编码多药外排泵的mdf(A)（2732/2732；100%），其次是sul2（1216/2732；44.5%）、sul1（982/2732；35.9%）和bla_CMY-2（967/2732；35.4%）。代表林可酰胺类、大环内酯类、酚类和喹诺酮类耐药的ARGs和突变仅存在于少数分离株中。值得注意的是，β-内酰胺ARGs在来自不列颠哥伦比亚省的分离株中更常见，占该地点耐药遗传决定簇的19.9%，而在加拿大其他地点则少于13%。来自魁北克省的大肠杆菌分离株每个基因组拥有的ARGs数量显著多于其他五个地区的分离株（5.4个ARGs对比3.4-4.7个ARGs）。

在表型测试的15种抗菌药物中，有13种表现出耐药/敏感表型与基因型高度一致（>86%）。对头孢曲松（82.3%）和头孢噻呋（78.3%）的耐药性观察到较差的一致性，这些耐药性与ResFinder中的特定耐药基因无关，必须按抗菌药物类别（头孢菌素类）进行分析。鉴定出17个与头孢菌素耐药相关的β-内酰胺酶基因，其中最常检测到的是bla_CMY-2（967/2,732；35.4%）和bla_TEM-1B（239/2,732；8.6%）。bla_CMY-2基因存在于91.1%和90.3%的对头孢曲松和头孢噻呋表型耐药的分离株中；然而，在少数对这两种抗菌药物表型敏感的分离株中也检测到了bla_CMY-2。在8株对头孢噻呋耐药的分离株中发现了bla_CTX-M-1基因，其中6株缺乏bla_CMY-2基因，并且该基因未在任何敏感分离株中检测到。类似地，两株对头孢噻呋表型耐药但缺乏bla_CMY-2的分离株，拥有bla_CMY-140或bla_CMY-22，而这些基因在敏感分离株中未发现。对氯霉素观察到最好的一致性，所有57株耐药分离株都携带三个ARGs（catA1、cmlA1或floR）中的一个。值得注意的是，两株对氯霉素敏感的分离株也携带cmlA1。ResFinder数据库中不存在与杆菌肽相关的ARGs，然而与CARD结果比较时，大多数（2426/2732；88.8%）分离株携带bacA。

2732株大肠杆菌分离株中最常见的STs是ST10、ST115、ST1914、ST4243和ST4253，代表了39%的分离株，而7.7%（211/2732）的分离株属于新的STs（新的等位基因组合）。与氨基糖苷类、β-内酰胺类、二氨基嘧啶类、磺胺类和四环素类抗生素相关的耐药决定簇在25个最常见的STs中广泛存在。最广泛的β-内酰胺酶基因是bla_CMY-2和bla_TEM-1B，分别存在于24个和21个最常见的STs中。磺胺类耐药基因sul2在ST1914和ST42中高度流行。

mdf(A)基因完全（100%）存在于预测的染色体contigs上。仅检测到少数林可酰胺类耐药基因，其中大多数（33/40）存在于染色体contigs上。相比之下，β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、酚类和四环素类耐药基因主要（>85%）与质粒contigs相关。与磺胺类相关的两个耐药基因sul1和sul2在染色体（48%）和质粒（52%）contigs上几乎相等地被检测到。我们还评估了质粒复制子类型的分布。最主要的复制子类型包括IncFIB、IncFIA和IncFIC，存在于42.1%–60.3%的分离株中。许多分离株的复制子类型被分配给一个rep_cluster，因为它们无法分配给已知的不相容性组。超过一半的2732株大肠杆菌分离株拥有5个或更多质粒。

SerotypeFinder将2732株大肠杆菌分离株中的2510株预测为376种血清型。总分离株中相当一部分（n = 215；7.9%）包含无法分型的O抗原，而只有7株分离株使用当前基因组流行病学中心数据库具有无法分型的H抗原。尽管预测了大量血清型，但绝大多数（85.1%或320/376种血清型）并不常见，发现于少于十个分离株中。156种血清型（41.5%或156/376）极为罕见，仅预测用于单个分离株。在大肠杆菌分离株中，血清型O22:H2、O17/O44:H45和O102:H6是最常见的，分别占分离株的6.7%、6.3%和6.1%。二十种最常见的血清型代表了1198/2732（44%）株大肠杆菌分离株。血清型O102:H6是安大略省大肠杆菌的主要类型（51/488；10.5%），但在其他地区较少见（5.7%–8.8%），并且仅分型了来自不列颠哥伦比亚省的两个分离株（0.4%）。而来自不列颠哥伦比亚省的分离株占血清型O132:H28（23/38；60.5%）和O25:H9（32/48；66.7%）分离株的一半以上。

使用VFDB，在2732株分离株中总共检测到170种毒力因子。其中，24种核心毒力因子由90%的分离株共享。十种毒力因子仅在一种分离株中发现，88种毒力因子在2732株大肠杆菌分离株中检测率低于10%。在检测到的170种毒力因子中，148种存在于至少10个分离株中。每个基因组检测到的毒力因子中位数为52个。仅在2732个大肠杆菌基因组中鉴定出两种毒素基因astA和sat，分别存在于54%和0.07%的分离株中。fyuA基因与irp2组合存在于23.5%的分离株中。

在所有测序的大肠杆菌分离株中，2528株（92.53%）携带与EAEC致病型相关的hlyE毒力基因，1299株（47.55%）携带与UPEC致病型相关的chuA毒力基因，2252株（82.43%）具有与APEC致病型相关的iss毒力基因。未在任何2732株大肠杆菌分离株中检测到与EIEC（ipaH）、EHEC（stx1或stx2）和ETEC（eltA、eltB或sta）相关的毒力基因。大多数大肠杆菌分离株由于基因重叠被鉴定为杂交致病型，最流行的致病型是EAEC/UPEC/APEC杂交（34.96%）、EAEC/APEC杂交（26.24%）和EAEC/UPEC/NMEC/APEC杂交（18.16%）。五株分离株未检测到致病型相关基因。

Discussion

本研究旨在表征从国家MBS中获得的超过2700株大肠杆菌分离株的大型集合，并随后进行了全基因组测序。大肠杆菌是一种高度多功能的微生物，可以在人类、动物和鸟类以及各种环境中定殖和持续存在。大肠杆菌基因组的高度可塑性使该细菌具有惊人的进化能力和获得新遗传元件的能力，导致从共生菌株中出现致病菌株，这突出了表征普通或非致病性大肠杆菌菌株的重要性。

2732株大肠杆菌分离株高度多样化，代表了加拿大肉鸡中376种独特血清型和236种STs。大肠杆菌无处不在，许多菌株是无害的，而其他菌株可引起人类和牲畜的严重疾病。虽然血清型O22:H2是这组大肠杆菌分离株中最常见的，但尚未证明它是人类疾病的主要原因。相比之下，倾向于携带stx1和stx2并属于STEC致病型的大肠杆菌O22:H8在文献中常见，但在我们的分离株集合中缺失。类似地，血清型O21:H16、O26:H11、O103:H2、O111:NM和O113:H21经常与人畜共患感染相关，但这些血清型在我们的集合中仅代表两个分离株。我们还注意到，我们的分离株中只有九株属于ST131，这是一种重要的大肠杆菌谱系，可能从食用动物传播给人类，并已成为当今传播中最普遍的肠外大肠杆菌（ExPEC）克隆之一。尽管在我们的集合中发现了少量与人类感染相关的血清型，但我们确定了136株禽类分离株，代表了超过20种STs，这些STs与NCBI病原体数据库中的临床分离株聚类（10-59个单核苷酸变异（SNVs））。在这些分离株中，只有一株ST131分离株属于一个临床簇（SNP簇PDS000036436.5；~28个SNVs）。这突显了普通细菌（如大肠杆菌）的分离可以揭示与临床分离株的新联系，这在针对特定致病型时可能无法识别。

大多数大肠杆菌研究集中于与人类严重感染或暴发相关的致病菌株，而普通大肠杆菌的研究仍然不足。据我们所知，这是第一份表征来自禽类的大量普通大肠杆菌分离株的报告。非致病性大肠杆菌虽然不太可能引起人类疾病，但可能携带耐药基因或突变，这些基因或突变可能水平转移给致病性大肠杆菌菌株或其他物种。

在这里，我们评估了计算机检测耐药决定簇是否能准确预测大肠杆菌的耐药表型。在1122株进行表型抗菌药敏感性测试的大肠杆菌中，对于大多数抗菌药物（13/15），基因型预测与表型检测的耐药性高度一致（>86%）。对第三代头孢菌素（如头孢噻呋和头孢曲松）的耐药性更难在计算机上预测，因为ResFinder中没有基因或PointFinder中的突变指定对头孢噻呋的耐药性（仅对β-内酰胺类）。尽管在我们的分析中具有中间耐药水平的分离株被归类为敏感，但94%（66/70）对头孢噻呋具有中间MIC值的分离株携带bla_CMY-2，该基因在90%（299/331）的耐药分离株中发现。二十四株分离株对头孢噻呋耐药但不拥有任何一个已知的β-内酰胺酶耐药基因。在敏感菌株中检测到bla_CMY-2可能归因于低基因表达。然而，在先前的研究中观察到药敏试验的变异性，表明表型耐药性可能存在波动。需要对这些分离株进行进一步表征以解释其耐药基因组机制。类似地，91.1%（369/405）的对β-内酰胺抗生素头孢曲松耐药的分离株携带bla_CMY-2。在大肠杆菌分离株中，bla_CMY-2，其次是bla_CTX-M-1，似乎是赋予对头孢噻呋和头孢曲松耐药的主要基因。55%的分离株（620/1122）对四种或更多抗菌药物表型耐药，而17%（193/1122）对所有药物敏感；然而，编码对四环素类、酚类和大环内酯类耐药的多药耐药（MDR）外排泵的mdf(A)基因存在于所有测序分离株中，因此由于其缺乏特异性而被排除在我们的