饲料添加鼠李糖乳杆菌LGG对接种大西洋鲑的微生物组及杀鲑气单胞菌攻毒抗性的初步研究

　　本刊推荐：本研究通过一项严谨的动物实验，探讨了饲料中添加人源益生菌鼠李糖乳杆菌GG株（Lactobacillus rhamnosus GG, LGG）对已接种疫苗的大西洋鲑（Salmo salar）在杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida, Asal）攻毒后的抗病能力及皮肤黏液与粪便微生物组的影响。结果显示，LGG投喂未显著改善鲑鱼的生长性能（体重与体长）或提高其对Asal2004感染的抗性（P > 0.05），但感染显著改变了皮肤与肠道菌群结构（如Clostridium sensu stricto、Aeromonas和Photobacterium丰度变化）。研究强调，感染对微生物组的影响远大于益生菌干预，为水产养殖中抗生素替代策略的开发提供了重要参考。

　　

Abstract

在 aquaculture 中，益生菌的使用被视为一种可替代抗生素的策略，以减缓抗菌药物耐药性（AMR）的蔓延。本研究旨在探究通过饲料投喂鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG, LGG，ATCC 53103）对接种疫苗的大西洋鲑（Salmo salar）的体重、体长、皮肤黏液及粪便微生物组的影响，并评估其对杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）菌株2004-05MF26（Asal2004）攻毒后的死亡率。研究结果显示，投喂LGG未对鲑鱼的体重、体长或其对抗Asal2004感染的抗性产生显著改变（P > 0.05）。然而，感染显著改变了皮肤黏液和粪便微生物组：例如，皮肤黏液中的Clostridium sensu stricto从3.14%增至9.20%，粪便中从1.39%增至3.74%（P < 0.05）；粪便中的Aeromonas从0.02%增至0.60%（P < 0.05）；Photobacterium从未被检出（0%）增至52.16%（P < 0.01），而Aliivibrio则从67.21%降至0.71%（P < 0.01）。感染后，LGG组皮肤黏液中的Lactococcus（9.93%）和Lactobacillus（2.11%）显著高于其他组（分别为4.14%和1.08%，P < 0.05）。总之，LGG投喂并未进一步增强已接种疫苗的大西洋鲑的抗病能力，而Asal2004感染对皮肤黏液和粪便微生物组的影响远大于LGG投喂。

Introduction

杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, Asal）是引起鲑鱼类 furunculosis 的病原体，对全球 aquaculture 行业造成经济损失。许多Asal菌株携带位于质粒上的抗菌药物耐药基因（ARGs），例如在加拿大魁北克、新不伦瑞克和新斯科舍分离到的菌株携带具有多药耐药基因的质粒（如pSN254b）。Asal2004菌株（分离自2004年芬迪湾的患病鲑鱼）携带包括tetA、floR和sul1在内的多个ARGs，以及I类整合酶基因intI1。这些ARGs可通过水平基因转移传播至环境。2022年，加拿大海水鱼类生产中氟苯尼考和土霉素的使用量分别约为4.6吨和5.7吨。

加拿大已制定《泛加拿大抗菌药物耐药性行动计划》，倡导联邦、省和地区部门合作，促进负责任使用抗生素、推动新治疗方法的研发与创新，并加强监测措施。该计划的核心是开发抗生素替代品，以在“One Health”框架下减少抗生素使用和缓解AMR。

在加拿大，主要鲑鱼生产企业已采用疫苗接种控制Asal。同时，aquaculture 中的益生菌已被证明可保护鱼类抵御疾病，改善其整体健康与收获品质。针对大西洋鲑的益生菌主要有两类：通过浸泡施用的革兰氏阴性菌（如Vibrio或Aliivibrio）和作为饲料添加剂使用的革兰氏阳性乳酸菌（如Lactobacillus和Pediococcus）。鼠李糖乳杆菌LGG是一种商业化人用益生菌，先前研究显示其可通过免疫刺激提高虹鳟（Oncorhynchus mykiss）对Asal的抗性，但其对大西洋鲑的影响尚未被评估。

本研究在加拿大新不伦瑞克省圣安德鲁斯的研究设施中，评估了饲料投喂LGG对大西洋鲑的影响，测量了鲑鱼的体长与体重，并通过16S rRNA V4区扩增子测序分析了皮肤黏液和粪便微生物组的变化，同时评价了鲑鱼对Asal2004攻毒的死亡率。

Materials and methods

Ethics approval

所有动物实验均严格按照加拿大动物护理委员会《实验动物护理与使用指南》进行，协议经海洋区域动物护理委员会批准（动物使用协议编号：23-21）。所有鱼类操作均在Syncaine?麻醉下进行。

Animal source and husbandry

大西洋鲑幼鱼（平均体重60克）购自新不伦瑞克省一家商业孵化场，运送至圣安德鲁斯生物站（SABS）。鱼类在12°C（±1°C）的脱氯淡水下饲养2周，自然光周期，之后根据生长速率和成熟度评分（体银化、无幼鲑斑、尾鳍远端变暗）转移至海水。在海水（12°C ±1°C，经沙滤和UV处理）中饲养24周直至攻毒实验。淡水阶段每日投喂1%–3%体重的干颗粒饲料（Skretting），转入海水后投喂率降至1%体重/天。

Animal study design and sample collection

研究时间线如图1所示。大西洋鲑接受三种饲料之一：（1）标准饲料；（2）鳀鱼油（每周一次10 mL鳀鱼油/300 g标准饲料，其余时间标准饲料）；（3）LGG（每周一次10¹⁰ CFU LGG加10 mL鳀鱼油/300 g标准饲料，其余时间标准饲料），持续30周。投喂在转移至海水前开始，每组100尾鲑鱼每桶，包括标准饲料组（n = 4桶）、鳀鱼油组（n = 2桶）和LGG组（n = 2桶）。第23周时，鲑鱼被转移至生物安全实验室并重新分组为12桶（50尾/桶）。此时（LGG投喂24周后），标准饲料组有n = 6桶（3桶用于Asal2004攻毒，3桶作为“无Asal对照组”），鳀鱼油组n = 3桶，LGG组n = 3桶。皮肤黏液和粪便拭子在LGG投喂后4周和24周（攻毒前）采集。鲑鱼体重和体长在LGG投喂后2、4、6周测量（每桶10尾随机鲑鱼），研究结束（30周）时每桶20尾鲑鱼测体重。

Bacterial strains, culturing, and preparation

LGG菌株购自美国模式培养物集存库（ATCC），在37°C好氧培养于乳杆菌MRS肉汤（Hardy Diagnostics）。新鲜制备的LGG经离心沉淀，PBS洗涤3次，然后与300 g饲料和10 mL鳀鱼油在食品处理器中混合3分钟后投喂。为保障LGG活性，每2–3周制备新鲜批次并储存于4°C，投喂前立即混合饲料与鳀鱼油。

Asal2004菌株由Pascal Boudreau博士（加拿大渔业与海洋部）惠赠。通过全基因组测序（MiSeq平台）确认菌株身份、毒力因子、ARGs、质粒和整合酶基因的存在，并与先前研究比对。

Asal2004 intraperitoneal injection challenge

大西洋鲑后幼鱼通过腹腔（i.p.）注射“特洛伊”鱼（注射鱼）进行Asal2004攻毒，注射100 μL of 10⁷ CFU/mL Asal2004于PBS中，之后与未注射鱼共居感染。Asal2004在15°C好氧培养于TSB肉汤（添加120 μmol/L 2,2′-联吡啶）。细胞经离心沉淀，PBS洗涤3次，注射前进行细胞计数和系列稀释。注射后，鱼类分配至三个重复桶（每桶500 L，50尾鱼），在12°C（±1°C）沙滤UV处理海水（32 ppt）中，以8 L/min流动系统饲养。每日监测疾病临床症状、摄食表现、发病率、水温、氧饱和度和盐度。鲑鱼麻醉使用50 mg/L Syncaine?。

特洛伊鱼注射剂量通过预实验确定：10%特洛伊（n = 2桶，2尾鱼注射10⁴、10⁵、10⁶、10⁷ CFU Asal2004；平均体重~150 g）和20%特洛伊（n = 2桶，6尾鱼注射10⁴、10⁵、10⁶、10⁷ CFU Asal2004；平均体重~400 g）进行Asal2004 i.p.注射和死亡率监测。

DNA extraction

皮肤黏液和粪便拭子的DNA在LGG投喂后24周（攻毒前1周）和25周（攻毒后1周）提取。使用DNeasy? Blood & Tissue Kit（Qiagen），按革兰氏阳性菌指令进行，裂解缓冲液孵育90分钟以确保革兰氏阴性和阳性菌DNA均有效提取。提取DNA用于PCR确认LGG存在和后续微生物组分析。

PCR confirmation of the presence of LGG

提取DNA通过菌株特异性PCR扩增检测LGG存在。扩增产物在QIAxcel Advanced System（Qiagen）上处理，使用QX DNA Screening Kit，对齐标记15 bps和3 kb。

Library preparation and sequencing

使用16S rRNA基因V4区引物F515和R806（含Illumina索引）对样本总DNA进行扩增，进行配对末端测序分析细菌群落组成。PCR条件：95°C 2分钟，25个循环（95°C 20秒，55°C 15秒，72°C 1分钟），最后72°C延伸10分钟，4°C保存。PCR产物经AMPure XP beads纯化，Quant-iT^TM dsDNA High-Sensitivity Assay Kit定量，按Illumina? 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation协议在McGill University MiSeq平台测序。

Data analyses

序列读段在Mothur（v.1.48.0）处理，使用16S rRNA参考数据库（RDP trainset9_032012）进行分类。扩增子序列变异（ASV）分析、α和β多样性计算、统计分析、LEfSe（线性判别分析效应大小）生物标志分析和可视化在MicrobiomeAnalyst进行，包括稀薄至最小文库大小（无数据缩放）。 taxa丰度（百分比总量）使用MicrobiomeAnalyst计算。

Statistical analyses

体重和体长比较（LGG投喂后2、4、6周）采用单因素ANOVA分析各处理组10尾随机鲑鱼的平均值。研究结束（30周）体重比较采用单因素ANOVA分析各处理组20尾随机鲑鱼的平均值。 taxa丰度比较采用单尾t检验（LGG饲料组与其他组之间，含与不含鳀鱼油饲料组之间）。皮肤黏液和粪便微生物组的α多样性计算采用Kruskal–Wallis检验。

Results

LGG feeding on weight, length, skin mucus, and faecal microbiomes

大西洋鲑在淡水阶段每周投喂约10⁹ CFU LGG每桶。总体而言，LGG投喂未影响鲑鱼的体重或体长（图2）。研究结束（30周）时，各处理组平均体重无显著差异（P > 0.05）。

LGG投喂后24周（攻毒前）和25周（攻毒后），通过16S rRNA V4区扩增子测序分析皮肤黏液和粪便微生物组。共534,166条读段通过过滤，平均每样本11,128条。去除单例后鉴定出1092个ASV。皮肤黏液和粪便中的优势属包括Aliivibrio、Photobacterium和Streptococcus（图3）。

Asal2004感染对鲑鱼皮肤黏液和粪便微生物组产生巨大影响。 notably，Clostridium sensu stricto（包含重要人和动物病原体）在皮肤黏液中的平均丰度从3.14%增至9.20%，在粪便中从1.39%增至3.74%（P < 0.05）。Aeromonas在粪便中的平均丰度从0.02%增至0.60%（P < 0.05）。此外，粪便中Aliivibrio从67.21%降至0.71%（P < 0.01），Photobacterium从未被检出（0%）增至52.16%（P < 0.01）。

LGG投喂对攻毒前皮肤黏液或粪便微生物组的影响不显著。然而，感染后，LGG组皮肤黏液中的Lactococcus（9.93%）和Lactobacillus（2.11%）显著高于其他桶（分别为4.14%和1.08%，P < 0.05）。

Asal2004感染显著增加了粪便微生物组的Shannon和Simpson指数（α多样性）（P < 0.02；图4A）。LGG投喂组的Shannon和Simpson指数略高于其他组（攻毒前和图4B；攻毒后和图4C），但差异不显著（P > 0.05）。感染后粪便微生物组的Shannon和Simpson指数均显著增加（P < 0.02；图4C）。感染或LGG投喂均未改变皮肤黏液的Shannon或Simpson指数（数据未显示）。

感染也显著改变了皮肤黏液（图5A）和粪便（图5B）微生物组的β多样性（NMDS应力水平0.1–0.15）。LGG与其他饲料组之间在攻毒前或后均无显著差异（P > 0.05）。进一步LEfSe分析确认，Aliivibrio是感染前的生物标志物，而Photobacterium在感染后变得丰富（图S1）。

LGG feeding did not further improve the resilience of vaccinated salmon to Asal2004

为探究LGG是否降低Asal2004攻毒后的死亡率，在LGG投喂第25周通过i.p.注射和共居进行攻毒研究。本研究所用鲑鱼已接种ForteVII?疫苗（含福尔马林灭活A. salmonicida）。总体而言，疫苗对共居鱼表现出良好保护，感染后1个月累计死亡率仅10%–13%（图6）。LGG投喂组与其他组之间的死亡率无差异（P > 0.05）。

Discussion

本研究中，LGG未降低死亡率，很可能因为鲑鱼已接种抗A. salmonicida疫苗，与先前使用未接种虹鳟的研究相反。尽管未通过平板培养验证LGG存活性，但通过菌株特异性PCR在攻毒后（第25周）的粪便拭子中检测到LGG，而攻毒前（第24周）未检测到。这表明LGG成功附着鲑鱼肠道壁，直至Asal2004感染损伤肠道壁，导致攻毒后粪便拭子中含有LGG。因此，改进粪便样本收集方法（如使用粪便颗粒而非拭子，甚至刮取）可能提高LGG检测率。攻毒后粪便样本中检测到Aeromonas（丰度0.2%–0.7%），表明感染发生，但并非所有Asal2004桶均检测到，可能由于桶内分布不均且采样鲑鱼子集包含的Aeromonas低于检测限。

还观察到鲑鱼死亡率受生长阶段影响。即使特洛伊比例较低（10% vs. 20%）且每桶鱼数较少（20 vs. 30尾），体重~150 g鲑鱼的总体死亡率高于~400 g鲑鱼（图S3）。这可能因为海水暴露早期阶段的鲑鱼更易感A. salmonicida，因为急性 furunculosis 通常报道于幼鲑、 smolts 和鲑鱼类海水网箱第一年。

值得注意的是，Streptococcus在多数鲑鱼中丰度较高，尤其在皮肤黏液样本。攻毒前（第24周），LGG和鳀鱼油组皮肤黏液中的平均丰度为52%，而标准饲料组为18.6%（P = 0.005）。这表明鳀鱼油可能促进了皮肤黏液中的Streptococcus优势，这在文献中尚未描述。Streptococcus在大西洋鲑中的作用至今不明， except for S. phocae，一种鲑鱼 aquaculture 中的新兴病原体。由于排除污染引入Streptococcus的可能，且幼鲑抵达研究设施时无临床症状，值得进一步探究非致病性Streptococcus如何贡献大西洋鲑健康。

Asal2004感染基于α、β多样性和LEfSe分析显著改变了皮肤黏液和粪便微生物组。Aliivibrio从平均67.21%降至0.71%（P < 0.01），而Photobacterium增至52.16%（P < 0.01；图3）。可能是海水（流动设施，UV处理进水；非无菌）中的微生物组变化导致Aliivibrio和Photobacterium丰度差异。本研究的鲑鱼皮肤黏液以Streptococcus和Rothia为主（图3），不同于挪威研究设施中收集的后幼鲑皮肤黏液（以Lysobacter、 Acidobacteria 门未培养菌、 Pseudomonas、 Ralstonia、 Lactobacillus 和 Methylobacterium 为主）。这表明饲养海水和/或饲料会在鲑鱼皮肤黏液留下独特微生物组。对于粪便微生物组，同属 Vibrionales 的Aliivibrio和Photobacterium是优势 taxa。塔斯马尼亚网箱成年大西洋鲑的另一研究也报道，无论季节， Vibrionales 在粪便微生物组中占主导。 Photobacterium 也在北极地区研究设施的大西洋鲑肠道微生物组中占优势。同一团队进一步证明，秋季鲑鱼肠道微生物组中 Photobacterium 占主导，与本研究时间线（8月至次年2月）一致。此外，本研究显示，尽管接受相同处理，鲑鱼的皮肤黏液和粪便微生物组在桶间存在变异，与智利同一养殖场不同网箱大西洋鲑肠道中Aliivibrio高变异的观察一致。

总体而言，本初步研究表明，6个月饲料添加益生菌LGG未改变大西洋鲑的皮肤黏液或粪便微生物组。疾病抗性方面需通过攻毒其他目前无疫苗病原体进一步探索。

Acknowledgements

感谢Cooke Aquaculture Inc.（加拿大）提供鲑鱼，Pascal Boudreau博士（DFO）提供Asal2004。感谢Ann Kinney（DFO）协助鲑鱼饲养和样本收集；Scott Hrycauk（AAFC）进行细菌培养；Mruthula Narayan（不列颠哥伦比亚大学）、Skyler Umlah（红鹿理工学院）进行DNA提取和PCR。感谢Stewart C. Johnson博士（DFO）和Steve Charette博士（拉瓦尔大学）的建设性讨论。