即食冷冻核果中第三代头孢菌素和碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌的灵敏检测与回收方法的开发及评估

　　本研究报告开发了一种灵敏的检测方法，成功从即食冷冻核果中回收了产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶（CP）的肠杆菌目细菌（EB）。研究在椰子等样品中发现了携带高优先级耐药基因（如blaCTX-M-15、blaNDM-1/5）的临床相关菌株，并通过全基因组测序（WGS）和药敏试验（AST）证实其多重耐药性。该研究为评估食物链在抗菌素耐药性（AMR）传播中的作用提供了关键的监测方法和数据支持。

　　

引言

抗菌素耐药性（AMR）是一个紧迫的全球公共卫生问题，导致住院时间延长、医疗成本上升和高死亡率。世界卫生组织（WHO）将产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶（CP）的肠杆菌目（ESBL-EB和CP-EB）列为重点研究和应对的耐药菌。ESBL能介导对包括第三代头孢菌素（3GCs）在内的多种β-内酰胺类抗生素的耐药性，而CP则能水解包括碳青霉烯类（最后一道防线抗生素）在内的所有β-内酰胺类药物，导致治疗选择极为有限。食物，特别是即食（RTE）食品，作为AMR传播的潜在载体，其作用尚未被充分了解。因此，开发灵敏的方法来检测和回收食品中的这些耐药菌，对于评估其风险和完善监测体系至关重要。

材料与方法

研究团队从加拿大渥太华和加蒂诺的超市购买了161份即食冷冻核果样品，包括椰子（41份）、芒果（40份）、鳄梨（40份）和桃子（40份），这些样品均源自加拿大以外的11个国家。样品在最佳食用日期前进行处理。

样品经过均质和富集后，使用非选择性Petrifilm?测定需氧菌总数（APC），并使用CHROMagar ESBL和添加头孢噻肟（CTX, 1 μg/mL）的麦康凯琼脂（MAC-CTX）对富集物进行计数，以回收对3GC不敏感的细菌。从平板上挑取形态不同的菌落进行纯化。

为了高效筛选大量分离株中的抗菌素耐药基因（ARG），研究采用了混合测序（Pool-seq）策略。即将来自同一样品类型的多个分离株的培养物混合，提取总基因组DNA进行测序，然后使用KMA工具比对NCBI AMRFinderPlus数据库以鉴定ARG。在检测到目标ARG的混合池中，再对池中的每个分离株进行PCR验证。

对PCR验证阳性的分离株进行全基因组测序（WGS），使用COWBAT流程进行组装和分析，通过Staramr鉴定ARG、MLST序列型（ST）和质粒类型，通过MOB-suite对质粒进行表征，并通过SNVPhyl分析菌株之间的相关性。

对一部分分离株使用肉汤微量稀释法进行抗菌药物敏感性试验（AST），依据CLSI指南判断耐药性。

为了分析富集物的菌群组成，对所有样品富集物的DNA进行16S rRNA基因V3-V4区测序，使用QIIME-2和DADA2流程处理数据，并进行Alpha和Beta多样性分析。

结果

微生物负荷与耐药菌回收

椰子样品的需氧菌总数（APC）最高，95%的样品可定量，平均达1.9 × 10⁵ CFU/g。经富集后，椰子样品中也显示出最高的3GC不敏感菌水平，在CHROMagar ESBL和MAC-CTX平板上平均回收率达7.8 × 10⁶ CFU/mL。鳄梨、芒果和桃子样品中的细菌载量和回收率相对较低。两种选择性培养基的计数结果无显著差异。

Pool-seq筛选与目标菌株鉴定

从131份有生长的样品中共纯化出611株细菌。通过Pool-seq筛选，在9份椰子和2份芒果样品的混合池中检测到了重要的ESBL基因家族，包括bla_CTX-M（10个池）、bla_SHV（6个池）和bla_TEM（6个池），还有一个椰子池检测到碳青霉烯酶基因bla_NDM。

随后对阳性池中的191个分离株进行PCR验证，并对其中的32株（28株来自14份椰子，4株来自1份芒果）进行了WGS分析。测序结果证实了Pool-seq和PCR检测到的所有bla_CTX-M、bla_SHV、bla_TEM和bla_NDM基因。

菌株特征与耐药性分析

在椰子分离株中鉴定出的菌种包括：肠杆菌（Enterobacter roggenkampii）、大肠杆菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、似肺炎克雷伯菌（K. quasipneumoniae）和乔治克吕沃菌（Kluyvera georgiana）。芒果分离株均为似肺炎克雷伯菌。

bla_CTX-M是最常见的ESBL基因，存在于84%的测序分离株中（27/32），其中bla_CTX-M-15等位基因占主导（26株）。这些菌株属于多个不同的ST型，显示出丰富的遗传多样性。在部分菌株中，bla_CTX-M-15基因位于预测的质粒上（如IncFIB、IncFII、IncY型），而在其他菌株中则预测为染色体编码。研究还发现了其他β-内酰胺酶基因，如多种bla_SHV等位基因和非ESBL基因bla_TEM-1B。

值得注意的是，从一份椰子样品中分离出一株产NDM的肠杆菌（E. roggenkampii），其携带bla_NDM-1基因，该基因位于一个接合型IncC质粒上。通过后续深入的菌落筛选，从另一份qPCR阳性但初筛阴性的椰子样品中，额外分离出一株携带bla_NDM-5和bla_OXA-484基因的大肠杆菌ST410，这两个基因分别位于不同的IncF型质粒上。

药敏试验（AST）显示，所有分离株均对氨苄西林耐药，除一株乔治克雷伯菌（仅携带bla_CTX-M-213）外，其余均对头孢曲松（3GC）耐药。几乎所有菌株均对三类以上抗菌药物耐药，被判定为多重耐药菌（MDR）。

qPCR检测与方法的敏感性评估

使用qPCR直接检测所有161份样品富集物DNA中的bla_CTX-M和bla_NDM基因。qPCR不仅成功检出了所有14份初筛阳性的bla_CTX-M样品，还另外指示了24份样品可能为阳性。增加DNA模板量后，又额外检出7份 presumptive阳性样品。对于bla_NDM，使用高浓度DNA也额外检出了4份 presumptive阳性样品。对部分qPCR阳性但培养阴性的样品进行更深入的培养验证，成功从其中两份样品中分离出了携带目标基因的菌株，证明了qPCR具有更高的灵敏度，但也暗示在背景菌群复杂、目标菌比例低时，基于培养的初筛方法可能会漏检。

富集物菌群组成分析

16S rRNA测序分析揭示了不同种类水果富集物菌群组成的显著差异。椰子样品的Alpha多样性（Shannon指数）显著高于其他三种水果。主坐标分析（PCoA）和PERMANOVA检验表明，商品种类和国家来源都对菌群β多样性有显著影响。

在菌群组成上，椰子样品表现出更高的复杂性，并且含有更高比例的ESKAPEE病原菌组成员，如肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、克雷伯菌属（Klebsiella）、不动杆菌属（Acinetobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）。这种复杂的菌群结构和特定致病菌成员的存在，可能与椰子样品中更高的AMR细菌流行率和多样性相关。

讨论

本研究成功开发并验证了一种结合了培养、高通量Pool-seq筛选、靶向验证和WGS分型的灵敏方法，用于从复杂的食品基质中检测和回收携带重要ARG的细菌。

应用该方法在进口即食冷冻核果中发现了临床重要的ESBL-EB和CP-EB，检出率为9.9%（16/161），且主要集中在椰子样品中。其中，携带全球流行性bla_CTX-M-15基因的菌株最为常见，且这些菌株呈现多重耐药表型。特别值得关注的是检出了携带bla_NDM-1和bla_NDM-5的CP-EB，后者所在的ST410大肠杆菌是全球关注的多重耐药克隆。

研究表明，某些食品（如本研究中的椰子）可能因其加工方式（或涉及更多手工处理）、初始菌群特性等原因，而具有更高的携带和传播AMR的风险。其富集物菌群多样性更高，且富含ESKAPEE病原菌组成员，这可能是其AMR细菌水平更高的指示标志之一。

尽管食物在AMR传播中的作用仍需进一步研究，但本研究的发现强调了对其进行持续监测的重要性。基因组流行病学对于追踪AMR至关重要，但目前食品来源的AMR细菌基因组数据在公共数据库中仍然不足，需要进一步充实以促进溯源和风险分析。

本研究建立的综合方法学框架为未来开展食品AMR监测、评估其潜在风险以及制定有效的公共卫生干预措施提供了实用的技术支持和科学依据。