比较宏基因组学揭示传统与自然畜牧生产系统中抗菌药物耐药基因丰度的有限差异

　　本综述通过宏基因组学方法，系统比较了传统（CONV）与自然（NAT）畜牧生产系统中牛、猪和鸡的粪便微生物组及耐药组（Resistome）。研究发现，除牛的部分菌门外，微生物组成在两种系统间无显著差异（q > 0.05）；抗菌药物使用（AMU）对主要抗菌药物耐药基因（ARG）类别丰度无影响，但猪的某些四环素耐药基因（如tetQ）在CONV系统中更丰富（q < 0.05）。研究证实，单一生殖周期内停止AMU未必导致ARG丰度或多样性立即下降，强调了多因素（如饮食、生理）对耐药性（AMR）的影响。

　　

Abstract

该研究从“One Health”视角出发，针对畜牧业中抗菌药物耐药性（AMR）的发展与传播问题，采用宏基因组学方法比较了自然（NAT）和传统（CONV）生产系统对肉牛、猪和肉鸡肠道微生物组及耐药组的影响。结果表明，在牛中，CONV系统的Bacteroidetes、Euryarchaeota和Spirochaetes菌门更丰富（q < 0.01），而猪和鸡的细菌组成无差异（q > 0.05）。抗菌药物耐药基因（ARG）的类别在不同畜牧物种中均未受AMU影响，但猪的多种四环素耐药基因在CONV中更丰富（q < 0.05）。研究结论认为，停止AMU未必会在单一生殖周期内立即降低ARG的丰度或多样性。

Introduction

抗菌药物耐药性（AMR）是全球人类健康、食品安全及环境与动物健康的重大威胁。其广泛影响具有复杂性和渐进性，需通过“One Health”框架——即人类、动物和环境健康相互关联的理念——来理解。抗菌药物使用（AMU）在One Health各领域中的适当性与AMR增加相关，尤其是人类、动物和植物中的抗菌药物误用。自然（NAT）畜牧生产作为新兴趋势，被认为可减缓AMR传播，但此前缺乏跨物种比较NAT与CONV系统的宏基因组学研究。本研究利用加拿大肉牛、猪和肉鸡的粪便及盲肠样本，通过宏基因组学分析微生物组组成、ARG丰度差异，并预测虽无物种内ARG丰度差异，但不同畜牧系统间存在差异。

Materials and methods

Collection of shotgun megtagenome dataset

Overview

研究共纳入142个肠道相关 shotgun 宏基因组，来源于加拿大三种畜牧生产系统：肉牛粪便（CONV n=30, NAT n=30）、猪粪便（CONV n=23, NAT n=43）和肉鸡盲肠内容物（CONV n=8, NAT n=8）。样本采集遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）指南，并经相应动物伦理委员会批准。所有测序数据公开于NCBI SRA。

Beef cattle (ruminant, mammal)

CONV和半数NAT肉牛样本来自育肥期饮食（85%大麦粒+10%大麦青贮），CONV添加5%补充剂（含48 ppm莫能菌素和11 ppm泰乐菌素）。另一半NAT样本来自背景期饮食（62%玉米青贮+27%大麦粒）。NAT牛未使用任何抗菌药物。DNA使用Illumina NovaSeq 6000测序（150 bp paired-end）。

Swine (monogastric, mammal)

CONV猪样本来自接受口服阿莫西林（300 mg/L）的母猪所产仔猪，且所有CONV公仔在3日龄时接受青霉素G普鲁卡因（300,000 U）注射。NAT猪在无抗设施中饲养。所有猪饲喂谷物基础日粮，仔猪料含锌氧化物（2500–3000 mg/kg）和硫酸铜（29–277 mg/kg），育肥料金属浓度降低。DNA使用Illumina NovaSeq 6000测序（150 bp paired-end）。

Broiler chicken (monogastric, bird)

CONV肉鸡在21日龄时采集盲肠样本，饲喂含55 ppm杆菌肽的基础日粮；NAT组饲喂无抗标准日粮。所有肉鸡日粮分 starter（0-10天）、grower（11-20天）和 finisher（21-30天）阶段。DNA使用Illumina HiSeq2000测序（100 bp paired-end）。

Metagenomic data analysis

数据管理使用Integrated Rapid Infectious Disease Analysis Platform，分析通过Galaxy工作流系统进行。序列经Trimmomatic v0.38去除接头和低质量读段（Phred score <30）。微生物分类使用Kraken v2，耐药组表征使用AMR++ v2.0流程和MEGARes v2.0数据库。后续统计分析使用R语言（v4.3.1）。

Data visualization and statistical analysis

Microbiome

使用phyloseq R包处理Kraken v2输出，去除脊索动物门读段以消除宿主污染。操作分类单元（OTU）丰度通过trimmed mean of M-values（TMM）法标准化（edgeR R包）。低丰度（<1%） taxa归类为“other”。CONV与NAT系统间菌门log2 fold-change比较采用ANCOM-BC方法，p值经Benjamini–Hochberg校正（q值）。

Resistome

MEGARes v2.0输出矩阵经内部代码重整，ARG丰度通过TMM标准化。去除需SNP确认或含“regulator”的基因（因不表型耐药）。统计采用ANCOM-BC与Benjamini–Hochberg校正。

Results

Comparative microbiome

门水平比较显示，微生物组组成主要由宿主物种决定，但CONV与NAT系统间存在变异。肉牛中最丰富菌门为Firmicutes（39.6%）、Bacteroidetes（24.9%）和Proteobacteria（19.7%）；肉鸡中为Firmicutes（67%）、Proteobacteria（17%）和Bacteroidetes（3.7%）；猪中为Firmicutes（51%）、Bacteroidetes（21.7%）和Proteobacteria（14.6%）。除肉牛外，AMU未影响任何物种的菌门丰度。次要菌门如Spirochaetes在牛中更 prevalent，Euryarchaeota在肉鸡中可忽略。定量比较显示，仅肉牛菌门在AMU实践中有差异（q < 0.05），Euryarchaeota和Spirochaetes在CONV到NAT中分别下降1.7和2.0倍（q < 0.01）。

Comparative resistome

所有ARG类别和畜牧物种中，CONV与NAT系统间 prevalence 无差异（q > 0.05）。最 prevalent ARG类别为氨基糖苷类、MLS（大环内酯-林可酰胺-链阳霉素）和四环素类，且在物种间一致。物种间比较发现，β-内酰胺类耐药基因在NAT猪中较高、NAT肉鸡中较低（但丰度均低），四环素耐药基因在牛中比肉鸡更 prevalent（q < 0.001），MLS ARG在牛中低于NAT肉鸡（q < 0.001）。氨基糖苷类或杆菌肽耐药基因类别无差异。MLS ARG在CONV实践中物种间无差异。ARG组水平分析显示，大多数组在AMU实践内无差异（q > 0.05）。牛中最丰富ARG组为tetQ、tetW和mefA；肉鸡为tetW、ermB和tetO；猪为tetW、tetQ和tetO，仅tetQ在NAT中较低（q < 0.05）。MLS或β-内酰胺ARG仅在猪中NAT系统较低（q < 0.05和q < 0.01），β-内酰胺在牛中亦较低（q < 0.05）。所有物种中，四环素耐药基因最 prevalent。

Discussion

本研究通过跨部门宏基因组学评估了AMU对ARG prevalence 和细菌系统发育的影响。既往研究显示牛粪便中Firmicutes和Bacteroidetes高丰度，与本研究中CONV和NAT样本一致；肉鸡盲肠样本中Firmicutes和Bacteroides高丰度，且Proteobacteria高于Bacteroidetes；猪粪便中亦以Firmicutes和Bacteroidetes为主。CONV与NAT管理实践比较中，部分菌门在三种系统中变异，但仅牛有额外差异（q < 0.01），可能与饮食转变（CONV和半数NAT牛为高淀粉育肥饮食）有关。预测饮食变化对 taxa 丰度的影响可能因物种消化生理和饮食差异而异，如猪中可发酵饮食增加Actinobacteria、Cyanobacteria和Spirochaetes；肉鸡低蛋白饮食增加Actinobacteria、降低Firmicutes和Proteobacteria。饮食和消化生理是分析微生物组组成的关键因素。

AMU未影响ARG类别丰度，表明除AMU外其他因素（如微生物组成）影响耐药组。某些 taxa 携带多数ARG，且环境历史暴露（即使NAT系统曾有暴露）可能导致ARG持久性。猪无抗农场显示ARG类别水平降低，但缺乏饮食信息；牛无抗研究未发现AMU与ARG因果关系；肉鸡中恩诺沙星治疗未导致ARG类别差异，但增加MLS、氨基糖苷类和四环素耐药基因丰度；猪中土霉素使用增加耐药类别和机制水平。表明AMU与ARG关系复杂，受多因素影响。

耐药组中，牛比肉鸡或猪有更多差异丰富的ARG（β-内酰胺类、MLS和四环素类），肉鸡和猪间无差异，可能与反刍动物消化系统复杂性有关。犊牛和猪耐药组相似，提示随牛瘤微生群发育而分化。畜禽粪便ARG丰度比较中，猪 manure 最高。需注意ARG存在未必导致表型耐药，转录组学可确认表达，但低表达可能不足 confer 耐药。

Conclusions

跨部门宏基因组学研究强调了AMR动态在不同畜牧物种和生产系统中的复杂性。饮食和消化生理显著塑造微生物组和耐药组，但AMU alone 未一致影响ARG类别丰度。仅在特定ARG组（多为四环素类）中，NAT系统丰度较低，尽管未使用四环素，可能源于历史AMU的选择压力。研究表明，给定畜牧生产系统内不同管理实践未在研究时间内大幅影响整体耐药组或微生物组，强调需进一步探索饮食、管理实践和微生物群落互作，以及制定综合考虑多因素的AMR缓解策略。