加拿大零售肉类中艰难梭菌的监测及其与社区获得性人类感染的基因组关联研究

　　本综述系统评估了加拿大零售肉类中艰难梭菌（Clostridioides difficile）的污染状况及其与社区获得性感染（CA-CDI）的基因组关联。研究通过全基因组测序（WGS）和核心基因组多位点序列分型（cgMLST）技术，首次发现零售猪肉分离株与临床菌株存在高度基因组相似性（2-11个单核苷酸变异），证实了食源性传播的可能性，为CA-CDI的One-Health防控提供了关键分子证据。

　　

Abstract

社区获得性艰难梭菌感染（CA-CDI）在加拿大持续引发关注，占加拿大医院感染监测计划（CNISP）报告病例的四分之一。本研究从加拿大零售猪肉（3/219, 1.4%）和牛肉（0/99, 0%）中分离出产毒艰难梭菌，通过PCR核糖体分型（PCR ribotyping）和全基因组测序（WGS）鉴定为ST1/RT027、ST8/RT002和ST10/RT015型，这些型别均曾从加拿大CA-CDI患者中分离。肉类分离株对测试抗菌药物普遍敏感，仅一株对克林霉素呈中介耐药。基因组分析显示，两个猪肉分离株与人类临床CA-CDI分离株通过核心基因组多位点序列分型（cgMLST）聚类，单核苷酸变异（SNV）分析进一步揭示其基因组相关性为2-11个SNVs。结果表明零售肉类可能是加拿大CA-CDI的低水平暴露源，且存在特定克隆的食源性传播潜力。

Introduction

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是革兰阳性厌氧芽孢杆菌，为发达国家医院获得性腹泻的主要病原体之一。2019年加拿大估计有16,070例CDI病例，2021年报告死亡率为2.2%。尽管多与医院感染相关，但加拿大住院CDI患者中约四分之一为社区获得性（CA-CDI），其在欧洲占比14%–26%，美国多中心队列研究中高达61%。CA-CDI的感染源和暴露途径成为重要科学问题。

基于One-Health框架，艰难梭菌可从自然环境、动物、农场环境及零售食品（海鲜、蔬菜、肉类）中分离，零售肉类被视为潜在暴露源。加拿大既往研究曾从零售肉类中分离产毒艰难梭菌，但尚未明确其与人类感染的直接传播关联。本研究旨在评估加拿大零售猪肉和牛肉中艰难梭菌的流行率，并通过与CNISP收集的人类临床CA-CDI分离株的基因组比较，探索One-Health continuum中的潜在关联。

Materials and methods

零售肉类样本采集

通过加拿大抗菌药物耐药性综合监测计划（CIPARS），2016–2018年从不列颠哥伦比亚省（西部）、阿尔伯塔省（西部）、安大略省（中部）和魁北克省（中部）购买零售猪肉（n=219）和牛肉（n=99）。样本来源为加拿大或未知产地（表S1）。肉类样本用BPW冲洗，收集冲洗液冷冻后送国家微生物学实验室（温尼伯）进行分离和鉴定。

艰难梭菌分离

采用改良方法进行分离：将100μL BPW冲洗液直接涂布于CDMN琼脂平板，厌氧培养48小时；同时进行选择性增菌，接种100μL冲洗液至含牛磺胆酸的CDMN肉汤，培养5–7天后进行乙醇休克处理，离心取沉淀接种布鲁氏菌琼脂，厌氧培养48小时。通过菌落形态和紫外荧光（365nm）筛选疑似菌落，经MALDI-TOF MS（Bruker microflex系统）确认物种。

分子与表型鉴定

通过PCR核糖体分型分析16S-23S间隔区，使用毛细管凝胶电泳分配核糖体型（RTs）。药敏试验采用Etest法测试克林霉素、甲硝唑、莫西沙星、利福平、替加环素和万古霉素，使用布鲁氏菌琼脂（含溶血羊血）并按CLSI标准判读。

全基因组测序

使用Omega-Mag Bind Universal DNA Kit提取DNA，Nextera XT建库，Illumina NextSeq1000（P1 300 kit）测序。

CA-CDI基因组比较的纳入标准

选择2016–2018年CNISP参与的44–45家医院中社区获得性或不确定来源的CDI分离株（表S2），重点比较RT027/ST1（n=33）、RT002/ST8（n=32）和RT015/ST10（n=26）型别。

基因组分析

使用fastp过滤Illumina读数，FastQC评估质量，MetaPhlAn2检测污染，RefSeq Masher确认物种。Shovill组装基因组，Quast评估组装质量。通过BLASTn进行毒素基因分析，PubMLST鉴定序列型（STs）。使用Ridom SeqSphere+进行cgMLST分析，最小生成树以≤6等位基因差异定义聚类。对含肉类分离株的cgMLST聚类运行SNVPhyl，使用内部参考和2/20 SNV密度阈值。用ape包处理newick文件，ggtree展示最大似然SNV系统发育树。

Results

零售肉类中艰难梭菌的流行率与特征

产毒艰难梭菌检出率为猪肉3/219（1.4%），牛肉0/99（0%）。分离株063-A-02（ST1/RT027）和180-A-01（ST8/RT002）来自2016年和2018年西部加拿大猪肉，169-A-04（ST10/RT015）来自2018年中部加拿大猪肉。除180-A-01对克林霉素中介耐药外，所有分离株对测试抗菌药物敏感。对应人类临床菌株则呈现可变耐药率：克林霉素31.3%–73.1%、莫西沙星27.3%–93.8%、利福平93.3%–100%（表1）。

零售肉类与人类临床CA-CDI分离株的比较

cgMLST分析显示，猪肉分离株063-A-02、169-A-04和180-A-01的复合型分别为5177、5179和7945。最小生成树中，063-A-02和169-A-04分别与8个和19个人类临床分离株聚类（图1A、2A），而180-A-01未与任何临床分离株聚类（图3A）。

SNV分析进一步揭示基因组相关性：169-A-04与人类ST10/RT015 CA-CDI分离株的SNV距离为2–11，并与14个分离株形成进化枝，其中4个分离株的收集年份（2018）和地区（中部）与肉类分离株一致（图2B）。两个2017年收集于中部和西部的临床分离株与169-A-04仅差2个SNVs。

063-A-02与人类ST1/RT027分离株的SNV距离为11–29，其中一株2016年西部临床分离株相差11个SNVs，但系统发育关系不密切（图1B）。

180-A-01由于未形成cgMLST聚类，与最近聚类临床分离株的SNV距离为123–133，且临床分离株间SNV距离为4–22（图3B）。无ST8/RT002临床分离株与180-A-01的收集年份和地区完全匹配。

Discussion

本研究显示的零售猪肉（1.4%）和牛肉（0%）中艰难梭菌低流行率，与加拿大既往监测研究（猪肉1.2%、牛肉0%、小牛肉3.4%）及另一项猪肉研究（1.8%）一致。三研究均检出RT027型，该型别在2015–2019年加拿大住院CDI患者中占主导，且与高发病率和高死亡率相关。

其他加拿大研究报道的零售肉类污染率较高（6.3%–20%），差异可能源于方法学因素：部分研究直接对肉样进行增菌和乙醇休克处理，而本研究使用肉类冲洗液；此外，既往研究多聚焦碎肉产品，而本研究涵盖碎肉和非碎肉（牛肉97/99为碎肉，猪肉仅4/219为碎肉）。时间差异也可能反映农业、屠宰和包装实践的变化。本研究使用冷冻冲洗液可能降低芽孢存活率，影响检出率。

全球零售肉类中艰难梭菌流行率变异较大（西班牙猪肉0%至美国某城市猪肉41.3%），一项荟萃分析报告生肉总体流行率为5.6%。标准化采样和分离方法有助于减少研究间变异。

药敏数据显示肉类与人类分离株的耐药性存在差异，但样本量小限制比较。虽所有肉类分离株型别均曾从加拿大CA-CDI患者中检出，但直接归因食源性暴露仍具挑战。 livestock-associated型别RT078/126（具人畜共患潜力）未在本研究及近期加拿大研究中检出，但占CNISP报告人类感染的0.8%–3.2%。

基因组关联需谨慎解读：cgMLST显示063-A-02和169-A-04与临床分离株密切关联（≤6等位基因差异），但仅169-A-04满足≤2 SNVs的严格阈值。缺乏流行病学数据限制直接传播事件的推断。本研究为回顾性设计，依赖现有监测样本，非反映当前流行状况，但首次揭示了零售肉类与CA-CDI的基因组联系。

综上，加拿大零售猪肉和牛肉中艰难梭菌流行率为0.9%，全基因组测序证实一株猪肉分离株与人类CA-CDI菌株高度相关，另一株通过cgMLST和SNV分析显示相似性。零售肉类可能是CA-CDI的低水平暴露源，但需进一步研究确定食源性传播能否导致人类感染。

Acknowledgements

感谢CIPARS提供零售肉类冲洗液样本，感谢CNISP各参与医院的医师、流行病学家、感染控制从业者和实验室人员。感谢国家微生物学实验室的质谱与蛋白质组学核心实验室（MALDI-TOF MS鉴定）、机器人支持实验室（DNA提取）和基因组学核心实验室（Illumina测序）的技术支持。