基于全基因组测序的沙门氏菌耐药性监测准确性提升：一项流行病学框架研究

　　本综述系统评估了全基因组测序（WGS）技术用于沙门氏菌耐药性（AMR）监测时，生物信息学分析参数（基因覆盖度COV与核苷酸一致性ID）对预测准确性的影响。通过大样本回归模型分析，揭示了参数设置与血清型、药物类别间的交互作用，为优化WGS-based AMR监测策略提供了关键实证依据。

　　

Abstract

全基因组测序（WGS）技术在细菌抗菌药物耐药性（AMR）监测领域展现出显著优势，但其检测准确性受生物信息学分析参数设置的显著影响。本研究基于加拿大禽类生产监测系统中收集的1633株海德堡和肯塔基沙门氏菌分离株的全基因组数据，采用StarAMR耐药基因预测工具，通过系统调整基因覆盖度（COV）和核苷酸一致性（ID）参数，评估不同参数组合对AMR预测准确性的影响。研究结果通过回归模型控制混杂因素后显示，参数设置对预测敏感性和特异性存在微小但显著的影响，且这种影响因血清型和药物类别而异。

1. Introduction

抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球公共卫生重大威胁，世界卫生组织呼吁加强监测体系建设。传统耐药性表型检测方法存在操作繁琐、时效性差等局限，而WGS技术能够同步获取耐药基因（ARG）、突变位点、可移动遗传元件等多元信息，为AMR传播机制研究提供全新视角。目前基于序列比对（如BLAST）的耐药基因检测工具虽广泛应用，但其参数设置（如COV和ID阈值）缺乏标准化规范，可能导致结果解读偏差。本研究旨在通过流行病学建模方法，量化分析参数设置对WGS-based AMR检测准确性的影响。

2. Methods

2.1. Data sources

菌株来源于2003-2015年加拿大抗菌药物耐药性综合监测计划（CIPARS）和加拿大食品检验局（CFIA）的禽类微生物基线研究，涵盖养殖场、屠宰厂和零售环节的样本。

2.2. Bacterial isolation, serotyping, and antimicrobial susceptibility testing

菌株经White-Kauffmann-Le Minor血清分型法或基因血清分型芯片鉴定。药敏试验采用肉汤微量稀释法（Sensititre CMV4AGNF板），使用CLSI折点判读17种抗菌药物的耐药性。

2.3. Whole-genome sequencing and in silico antimicrobial resistance detection

基因组DNA通过Illumina平台测序，使用Unicycler进行组装。耐药基因检测采用StarAMR（v.0.7.2）工具，整合Resfinder、Pointfinder和Plasmidfinder数据库，针对β-内酰胺酶基因设置100% ID特殊阈值。

2.4. Creation of modelling dataset

通过迭代分析（COV:60%-100%, ID:90%-100%）生成89,815条观测数据，将基因型检测结果与表型耐药性进行匹配比对。

2.5. Statistical analyses

使用R语言构建混合逻辑回归模型，分别计算敏感性和特异性。模型纳入ID、COV、血清型等变量及其交互项，通过随机截距控制菌株重复测量效应。

3. Results

3.1. Description of dataset

1633株沙门氏菌中海德堡血清型占84%（1364株），肯塔基血清型占16%（269株），样本主要来源于安大略省和魁北克省（65%）。

3.2. Results from in silico AMR detection using starAMR

共检测到44种耐药基因，其中98%的基因ID值集中在95%-100%区间。氨基糖苷类耐药基因（如aph(3″)-Ib, aph(6)-Id）在肯塔基血清型中检出率达85%，而海德堡血清型仅3%。bla_CMY-2基因在两组血清型中分别检出50%和88%。喹诺酮类耐药相关parC基因突变（T57S）在海德堡血清型中普遍存在（100%）。

3.3. Final model results

3.3.1. Aminoglycosides

氨基糖苷类耐药预测特异性随ID/COV值升高而增加，敏感性则呈下降趋势。肯塔基血清型的预测敏感性显著高于海德堡血清型（0.999999993–0.999999999 vs 0.03–0.86）。

3.3.2. Beta-lactamases（any bla-genotype）

β-内酰胺酶基因检测敏感性受ID、COV和血清型三重交互作用影响。肯塔基血清型在不同COV水平下的敏感性波动更为显著。

3.3.3. Beta-lactamases（bla_cmy-2 only）

bla_CMY-2特异性在肯塔基血清型中显著较低。当ID>95%时，较低COV设置（60%）可获得更高敏感性。

3.3.4. Tetracyclines

四环素类耐药预测敏感性范围在血清型间差异极大（海德堡:0.0135–0.446；肯塔基:0.9999996–0.9999999）。

4. Discussion

研究表明WGS-based AMR检测性能受多因素协同影响：①高严格度参数（ID/COV≈100%）虽提高特异性但降低敏感性；②短读长测序技术导致的基因组组装不完整可能影响基因覆盖度计算；③血清型特异性遗传背景导致不同菌株间存在检测效率差异；④同一耐药类别内多基因共存可能产生协同效应。建议针对特定病原体-药物组合优化参数设置，并考虑采用长读长测序技术提升基因组装质量。

5. Conclusion

WGS技术为AMR监测提供了强大工具，但其标准化应用仍需充分考虑分析参数、病原体特性和药物类别的交互影响。本研究建立的流行病学框架为优化监测策略提供了实证依据，建议监测项目根据目标菌株和药物类别进行参数本地化优化。