工程化诱导型接合质粒：开启可调控水平基因转移的抗微生物新策略

　　本综述系统探讨了利用细菌天然接合机制开发新型抗微生物疗法的前沿进展。面对日益严峻的抗菌素耐药性危机，研究团队创新性地通过阿拉伯糖诱导型启动子(pBAD)调控接合必需基因(trbC/trbF)，构建了在顺式(cis)和反式(trans)配置下均实现5个数量级诱导差异的接合质粒系统。这项工作为可控DNA转移技术奠定了关键基础，为下一代抗微生物制剂的安全应用提供了重要的生物防护策略。

　　

引言：全球健康危机与创新解决方案

抗菌素耐药性正成为全球健康的持续性威胁，包括细菌和真菌在内的多种微生物对所有已知抗微生物药物产生耐药性的能力令人震惊。近年来，由于对抗真菌治疗耐药性的上升，真菌病原体已成为重大威胁。世界卫生组织(WHO)在2022年发布了首份真菌优先病原体清单，凸显了全球范围内真菌感染带来的巨大公共卫生风险。农业领域同样面临挑战，植物病原真菌的抗药性威胁着全球粮食安全。

目前，基于细菌接合作用的新型抗微生物药物正在开发中。这是一种需要直接细胞间接触的自然水平基因转移机制。该过程利用IV型分泌系统(type IV secretion system)递送DNA，包括编码对目标受体有毒性的蛋白质的质粒，在递送后杀死受体细胞。接合作用可以在液体环境、固体培养基表面或内部发生。由于细菌接合可以用于原位递送，近年来人们对其重新用作抗细菌物种的抗微生物剂以及在小鼠微生物组模型中的应用兴趣日益增加。从细菌到酵母和藻类的跨界接合也已被证实。尽管具有潜在效用，但由于与细菌受体相比接合频率相对较低，跨界接合仍然受到限制。然而，合成生物学方法表明，工程化接合质粒可以将质粒转移到酵母的效率提高达23倍，并证明了工程质粒的抗真菌特性。随着优化质粒转移技术的进展，必须同时开展工程化生物防护特性的平行努力。

生物防护是部署接合质粒作为抗微生物剂的关键考虑因素。为了安全有效地使用这些系统，必须集成多层控制以确保精确调控，最大限度地减少暴露、误用或意外释放的风险。这些控制应包括以下特征：可诱导的接合机制、可诱导的靶基因表达以及可控的接合质粒消除。这些可诱导特性共同构成了强大的生物防护策略，解决了关于接合抗微生物技术的生态和安全影响的关键问题。

材料与方法

菌株和生长条件

受体大肠杆菌(Escherichia coli) Epi300带有染色体整合的新霉素抗性基因，在补充有新霉素(100 μg mL^?1)的LB培养基中生长。含有顺式(cis)质粒的大肠杆菌在补充有庆大霉素(40 μg mL^?1)的LB培养基中生长。含有反式(trans)质粒的大肠杆菌在同时补充庆大霉素(40 μg mL^?1)和氯霉素(30 μg mL^?1)的LB培养基中生长。所有处于诱导状态的质粒都用阿拉伯糖(100 μg mL^?1)培养，或在抑制状态下用葡萄糖(0.01 g mL^?1)培养。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) VL6-48在补充有腺嘌呤半硫酸盐(200 μg mL^?1)和氨苄青霉素(100 μg mL^?1)的2x YPAD培养基中生长。对于酵母接合实验，接合平板由缺乏组氨酸的完全最小(CM)葡萄糖培养基组成，其中含有10% LB和腺嘌呤半硫酸盐(80 μg mL^?1)，琼脂浓度为2%。选择平板由缺乏组氨酸的CM葡萄糖培养基组成，补充有腺嘌呤半硫酸盐(80 μg mL^?1)。接合平板和选择平板均未添加抗生素。

反式(trans)质粒构建

基因插入片段从pTA-Mob 2.0扩增，表达质粒使用pAGE2.0i模板通过三个重叠片段扩增。使用GXL聚合酶按照制造商的说明进行扩增。感兴趣的基因使用57-60°C的退火温度进行25-30个循环，骨架片段使用60°C退火温度进行30个循环。然后通过酵母介导的克隆使用四个片段组装质粒，并在选择培养基(缺乏组氨酸的CM葡萄糖培养基)上两次传代20个菌落。使用Qiagen Multiplex Kit对前10个菌落进行多重(MPX) PCR，使用诊断引物(BK888_F/R)，如果基因插入片段未整合，将产生214 bp的扩增子。阳性MPX克隆被分离并通过电穿孔转化到大肠杆菌中。三个克隆在补充有阿拉伯糖(100 μg mL^?1)的LB中生长，并使用miniprep柱分离DNA。通过使用BamHI在37°C孵育1小时进行诊断性消化筛选质粒DNA(约600 ng)。最终克隆(1-2个)通过PCR扩增并通过Sanger测序验证。

顺式(cis)质粒构建

可诱导质粒基于Cochrane等人创建的pSC5GGv1质粒。位于载体骨架中转移起点下游的traJ序列和天然trbF基因被删除。为此，使用pSC5.1作为模板扩增traJ删除片段，并使用trbF敲除质粒扩增trbF删除片段。可诱导基因构建体使用先前描述的方法插入到golden-gate着陆垫中。对于pSC6，trbF基因与由阿拉伯糖诱导型pBAD启动子驱动的mRFP和终止子一起从trbF诱导型质粒中扩增出来，通过引物介导添加BsaI限制位点和同源性，以插入到pSC5骨架中的I-SceI限制位点下游。

可诱导接合到细菌——固体培养基

大肠杆菌制备：供体和受体大肠杆菌在37°C、225 rpm摇动的5 mL LB培养基中过夜生长，接种单个菌落并补充适当的抗生素。饱和培养物在第二天稀释至OD₆₀₀为0.1，接入50 mL LB培养物中并补充适当的抗生素。供体菌株在三种状态下生长：诱导、未诱导和抑制。所有50 mL培养物生长至OD₆₀₀为1.0，并在3000 RCF下离心15分钟。离心后，弃去上清液，将供体和受体沉淀分别重悬于5 mL或0.5 mL冰冷的10%甘油中。将500 μL细胞等分试样在-80°C乙醇浴中冷冻并储存于-80°C。

接合：诱导、未诱导和抑制的接合平板(20 mL，1.5%琼脂，LB含适当补充物)在生物安全柜中干燥20分钟。在此期间，供体和受体菌株的等分试样在冰上解冻。供体和受体细胞以1:3的比例(33 μL:100 μL)加入Eppendorf管中，吹打混合后将总体积添加到相应的接合平板上并均匀铺开。平板干燥5分钟，然后在37°C孵育1.5小时，不叠放。接合期后，用750 μL冷无菌ddH₂O两次刮取平板到Eppendorf管中，将体积调整至1.5 mL，然后涡旋5秒。使用96孔板，进行从10^–1到10^–5的十倍系列稀释。对于顺式(cis)接合，将每个稀释度的100 μL铺在选择平板(20 mL，1.5%琼脂，LB含庆大霉素和新霉素)上。对于反式(trans)接合，将每个稀释度的25 μL与100 μL无菌ddH₂O混合，然后铺在选择平板(20 mL，1.5%琼脂，LB含庆大霉素和新霉素)上。平板干燥5分钟，然后在37°C孵育24小时。

可诱导接合到细菌——液体培养基

大肠杆菌制备：供体和受体细胞按照上述"可诱导接合到细菌——固体培养基"中的描述制备。

接合：供体和受体大肠杆菌的冷冻等分试样在冰上解冻20分钟。在15 mL Falcon管中，制备3 mL LB培养基，添加或不添加阿拉伯糖(100 μg mL^?1)补充，不含任何抗生素。然后向LB培养基中加入500 μL供体和50 μL受体。试管在37°C下不摇动孵育14小时。接合期后，将液体培养物吹打10次，并将200 μL(未稀释)铺在选择平板(20 mL，1.5%琼脂，LB含庆大霉素和新霉素)上。平板干燥5分钟，然后在37°C孵育24小时。

互补分析

使用上述"可诱导接合到细菌——固体培养基"部分中概述的方案，使用所有创建的带有反式(trans)质粒的供体菌株。然而，将每个稀释度的75 μL铺在选择平板上，然后在37°C孵育48小时。

可诱导接合到酵母

大肠杆菌和酿酒酵母制备：供体大肠杆菌在37°C、225 rpm摇动的5 mL LB培养基中过夜生长，接种单个菌落并补充适当的抗生素。受体酿酒酵母在30°C、225 rpm摇动的5 mL 2x YPAD中生长，补充有氨苄青霉素(100 μg mL^?1)。饱和培养物在第二天稀释至OD₆₀₀为0.1，分别接入50 mL LB或2x YPAD培养物中并补充适当的抗生素。大肠杆菌菌株在三种状态下生长：诱导、未诱导和抑制。供体和受体培养物分别生长至OD₆₀₀为1.0或3.0，并在3000 RCF下离心15分钟。离心后，弃去上清液，将供体和受体沉淀分别重悬于0.5 mL和1 mL冰冷的10%甘油中。然后将500 μL等分试样在乙醇浴中冷冻并储存于-80°C。

接合：诱导、未诱导和抑制的接合平板(20 mL，1.5%琼脂，10% LB培养基，缺乏组氨酸的CM葡萄糖肉汤含适当补充物)在生物安全柜中干燥20分钟。在此期间，供体和受体的等分试样在冰上解冻。然后向Eppendorf管中加入100 μL供体和受体细胞，吹打混合后将总体积添加到相应的接合平板上并均匀铺开。平板干燥5分钟，然后在30°C孵育3小时，不叠放。接合期后，用2 mL冷无菌ddH₂O刮取平板，并在15 mL Falcon管中重新调整体积，然后涡旋5秒。进行两个技术重复，将200和400 μL未稀释细胞铺在选择平板(30 mL，1.5%琼脂，缺乏组氨酸的CM葡萄糖肉汤)上。平板干燥5分钟，然后在30°C孵育5天。

统计分析

使用Student's t检验进行组间两两比较，根据F检验结果使用相等或不等方差。数据表示为至少四个生物学重复的平均值±标准误。当P < 0.05时认为检验具有统计学显著性(*)。

结果

为了制作反式(trans)可诱导接合质粒，我们使用了先前生成的资源，即接合质粒pTA-Mob 2.0的单基因删除库，并构建了相应的互补质粒。互补质粒包含由pBAD启动子驱动的单个基因。该启动子是阿拉伯糖诱导型的；由pBAD启动子驱动的基因转录可以通过添加阿拉伯糖诱导，并通过添加葡萄糖抑制。基于我们已发表的结果，我们选择了13个带有对从大肠杆菌到酿酒酵母接合必需的单基因删除的质粒。我们将这些质粒及其相应的互补质粒转移到大肠杆菌供体中，并在固体培养基上进行了接合实验。由于两种质粒(pTA-Mob 2.0删除和互补质粒)都具有转移起点，如果发生互补，一种和/或另一种可以被转移到受体细胞中。

我们的初步实验表明，13个删除质粒中有6个恢复了接合，但只有两个，trbC和trbF，在添加葡萄糖时显示出接合的完全抑制。即使没有抑制(未诱导条件)，我们也没有观察到这些基因的接合。因此，我们已经确定了两个强大的基因候选物，作为我们下一代可诱导接合质粒的基础。

为了进一步评估这种反式(trans)接合设置，我们进行了一个更大的实验，涉及四个生物学重复，用于trbF和trbC删除/互补质粒组合到大肠杆菌受体。我们的发现证实了初步结果，证明接合系统确实是可诱导的。然而，接合效率明显低于亲本质粒pTA-Mob 2.0，显示出近两个数量级的下降。虽然系统表现出一些泄漏性，但诱导导致接合效率显著增强，与未诱导条件相比，产生了大约四个数量级更多的转接合子菌落。

基于在反式(trans)可诱导接合质粒中的发现，我们设计了一种新型质粒pSC6，基于pSC5GGv1。在该构建体中，trbF基因被删除并在可诱导启动子和终止子下重新引入，以最小化相邻基因或操纵子的意外激活。与反式(trans)系统一样，我们的顺式(cis)接合系统表现出明确的可诱导性。然而，接合效率显著降低，与对照质粒pSC5相比，显示出大约两个数量级的下降。值得注意的是，诱导 substantially 提高了接合效率，实现了相对于未诱导条件三个数量级的增加。

最后，我们进行了初步实验以评估在液体培养物中从大肠杆菌到大肠杆菌的接合。我们的结果表明pSC6在这种环境中是可诱导的，但接合效率与对照质粒相比显著降低。鉴于我们的目标是在抗真菌技术中使用这种可诱导质粒，我们进一步测试了其接合到酵母中的能力。pSC6在诱导条件下仅产生八个菌落，没有诱导时未观察到菌落。虽然这些发现突出了接合系统可诱导控制的潜力，但需要进一步的工程化以实现与对照质粒相当的接合效率。

讨论

近年来，基于接合作用的抗微生物剂的开发引起了显著兴趣。然而，随着这项技术的发展，其局限性，特别是关于工程化质粒一旦释放到环境中后的控制问题，需要得到解决。创建可诱导接合系统是水平基因转移技术的基本要求。这类系统的一个重要例子是Brophy等人工程化来自枯草芽孢杆菌的ICEBs1系统的工作。这种整合和接合元件(ICE)促进了到未驯化细菌的高效和可诱导DNA转移。他们的方法涉及将IV型分泌系统与转移的DNA分离，最大限度地减少意外的遗传传播。

在我们的研究中，我们旨在开发一种顺式(cis)接合质粒，包含接合所需的所有组件，同时保持严格的控制。我们检查了13个对pTA-Mob 2.0质粒接合必需的基因，包括那些参与菌毛形成、组装和稳定性的基因(trbC, trbD, trbF, trbI, trbJ, trbL, traF)，松弛体复合物组件(traH, traJ, traK, traM)，以及松弛体与交配对形成系统的耦合(traG)。与菌毛形成和稳定性相关的基因删除通常适用于反式(trans)互补，而那些在松弛体复合物中的则不是。这种差异可能源于删除破坏了相邻基因的调控元件。未来的努力可以集中在创建点突变而不是完全删除以保持调控控制。我们确定了两个候选物，trbC和trbF，当使用pBAD启动子表达时表现出有效的互补。很可能trbC和trbF需要显著更高的表达水平来完全恢复它们各自的接合功能。因此，由启动子泄漏性引起的低基础表达可能不足以挽救表型，使这些基因特别适合严格的可诱导控制。然而，我们预测，通过精确调整基因表达，所有互补基因(包括trbD, trbL, traF, traG)都可以用于这种方法。

我们的发现使我们能够评估顺式(cis)和反式(trans)系统。在这两种配置中，我们都实现了可诱导性，尽管接合速率有所下降。这种减少可能源于trbC和trbF周围基因表达的改变。如上所述，解决这个问题可能涉及引入部分基因删除或点突变，并评估候选基因不同表达水平对恢复接合效率的影响。

加入可诱导启动子，如阿拉伯糖诱导型pBAD启动子，增加了必要的生物防护层。这种设计确保接合仅在特定条件下发生，减轻了与意外水平基因转移相关的生态风险。将trbC和trbF识别为严格调控的组件为未来的可诱导质粒设计提供了良好的基础。然而，像启动子泄漏性和降低的接合效率这样的挑战需要为实际应用而解决。此外，需要测试环境和物种特异性的可诱导启动子。向酵母递送质粒的能力突出了这些系统用于抗真菌应用的潜力。然而，观察到的跨界转移中的低接合效率需要得到解决，包括上述方法。此外，可以进行实验室加速进化以提高接合频率。总体而言，这项研究为可诱导接合质粒技术建立了一个基础框架，同时突出了抗微生物和基因工程应用中创新的挑战和机遇。